NYT 1460-2007饲料中盐酸克仑特罗的测定 酶联免疫吸附法.pdf

ICS 65.120B 46NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1460-2007饲料中盐酸克仑特罗的测定酶联免疫吸附法Determination of clenbuterol hydrochloride in feed-Enzyme-linked immunosorbent assay2007-12-18 发布2008-03-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 1460--2007前言本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心(北京)。本标准起草人：杨曙明、高生、范理、宋荣、马东霞、苏晓鸥。1 NY/T 1460—2007饲料中盐酸克仑特罗的测定酶联免疫吸附法1范围本标准规定了饲料中盐酸克仑特罗的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中盐酸克仑特罗的测定，2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法NY 438一2001饲料中盐酸克仑特罗的测定3原理利用抗原抗体特异性结合的特性和酶的高效催化作用，通过化学方法将辣根过氧化物酶(HRP)与克仑特罗(CL)偶联,形成辣根过氧化物酶标记克仑特罗。将固相载体上已包被的抗抗体(羊抗兔IgG抗体)与特异性的抗克仑特罗抗体结合，使抗克仑特罗抗体固相化，然后加人待测克仑特罗和辣根过氧化物酶标记克仑特罗，它们竞争性地与克仑特罗抗体结合，洗涤后加显色剂，根据显色剂的颜色变化计量待测克仑特罗量。若待测克仑特罗多,则被结合的酶标记克仑特罗少，显色剂颜色浅，反之则深。用目测法或比色法测定样品中的克仑特罗含量，比色的最佳波长为450nm。4 试剂与材料以下所用的试剂和水，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合 GB/T 6682中规定的三级水。4.1克仑特罗酶联免疫法测试盒组成。4.1.1包被羊抗兔IgG抗体的聚苯乙烯微量反应板，24孔、48孔或96孔。4.1.2克仑特罗抗体：多抗或单抗。多抗可以由兔或羊血清获得，效价应5000(间接ELISA法），或有效抗体含量应5mg/mL;IC5o1.0(间接竞争 ELISA法）。单抗由鼠腹水获得，效价应5000(间接 ELISA法），或有效抗体含量应5mg/mL;ICso1.0(间接竞争 ELISA 法）。4.1.3 盐酸克仑特罗的标准溶液，6 个浓度：0 ng/ mL、0.1 ng/ mL、0.3 ng/ mL、0.9 ng/ mL、2.7 ng/ mL.8. 1 ng/ mL4.1.4辣根过氧化物酶标记克仑特罗：交联比为6～12：1，以偶联物浓溶液保存，使用前需用4.1.5液稀释。4.1.5辣根过氧化物酶标记克仑特罗稀释液：含0.01mol/L～0.05mol/LpH7.5磷酸钠缓冲液(PBS)，加入0.05%吐温-20,0.1%牛血清白蛋白。4.1.6洗涤缓冲液：含 0.01 mol/L～0.05 mol/L pH7.5磷酸钠缓冲液(PBS),加入 0.05%吐温-20。4.1.7底物液：过氧化氢，浓度为0.3%。4.1.8显色剂液:用 pH 5.0乙酸钠一柠檬酸缓冲液配制0.2g/L的四甲基联苯胺溶液。1 NY/T 1460—20074.1.9终止液：2mol/L硫酸溶液。4.2 甲醇。4.3 盐酸溶液:c(HCI)=0. 1 mol/ L。4.4 氢氧化钠溶液:c(NaOH)=1 mol/L。5仪器、设备5.1实验室常用仪器、设备。5.2分析天平,感量 0.0001g。5.3酶标仪,带有 450 nm 滤光片。5.4 离心机,10 000 r/min。5.5震荡器。5.6超声波发生器。5.7 微量移液器:20 μL,50 uL,100 μL,200 μL。6样品的制备取具代表性的饲料样品，用四分法缩减分取200g左右，粉碎过0.45mm（40目）孔径的筛，充分混匀,装人磨口瓶中备用。7 分析步骤7.1样品处理7.1.1称取约1g样品,精确到0.0001g,放人15mL离心管中。7.1.2加人1mL盐酸溶液(4.3),混匀。7.1.3 加人9mL水,混匀。7.1.4在超声波发生器(5.6)中超声20 min，得到试样提取溶液，在离心机（5.4)上2000 r/min离心20 min.7.1.5取0.5mL上清液置于15mL离心管中用氢氧化钠溶液(4.4)调pH至7～9;对于矿物质预混料等偏酸性样品，可用更浓的氢氧化钠溶液调 pH至 7～9,避免中和用碱溶液体积过