土壤酶测定方法.doc

土壤酶测定方法 芳基酰胺酶 Arylamidase （EC 3.4.11.2） 试剂： 1、THAM缓冲液（0.1 M，pH 8.0）：2.44 g 三羟甲基氨基甲烷溶于50 mL水中，用0.05 M H2SO4滴定调节pH，加水稀释溶液至200 mL。 2、L-leucine β-naphthylamide solution L-亮氨酸β-萘胺（8.0 mM）：称取0.2342 g L-亮氨酸β-萘胺盐酸盐溶于水，定容至100 mL。3、Ethanol 乙醇：（95%） 4、Acidified ethanol 酸化乙醇（0.26 M HCl）：4.32 mL浓HCl加入乙醇中，用乙醇定容至200 mL。5、p-Dimethylaminocinnamaldehyde solution 对二甲氨基肉桂醛溶液 (0.6 mg/mL)：0.12 g 对二甲氨基肉桂醛溶于乙醇，用乙醇定容至200 mL。 6、标准液β-萘胺溶液（β-naphthylamine）（125 ug/mL）：称取12.5 mg β-萘胺，75 mL蒸馏水，5 mL乙醇，用蒸馏水定容至100 mL。 7、β-萘胺标准曲线：分别吸取1，2，3，4，5，6 mL标准液β-萘胺溶液（125 ug/mL）与25 mL容量瓶，定容。标曲溶液浓度分别为：5，10，15，20，25，30 ug/L β-萘胺 。 步骤： 1、称取1 g土壤（风干，2 mm）于25 mL 三角瓶，加入3 mL 0.1 M 的THAM缓冲液（pH 8.0），1 mL 8.0 mM 的L-亮氨酸 β-萘胺盐酸盐。三角瓶涡旋几秒，混匀，密封，放置在震荡培养箱1 h（37oC）。 2、 培养结束后，加入6 mL乙醇（95%）终止反应，土壤悬浮液立即混匀，转移至离心管，在17000xg离心1 min。 3、将上层清液转移至测试管，阻止基质的进一步水解。吸取1 mL上层清液至另一个测试管，加入1 mL乙醇，2 mL 酸化乙醇，2 mL对二甲氨基肉桂醛溶液，混合溶液涡旋混匀，红色偶氮化合物在540 nm下比色。 4、当红色偶氮化合物的浓度超过最高浓度的标准β-萘胺溶液，能整除的红色偶氮化合物用乙醇稀释，直到在表曲线上。按照每1 mL标曲溶液，加入1mL乙醇，2 mL酸化乙醇，2 mL对二甲氨基肉桂醛。 5、对照处理，1 mL的基质在培养结束后加入。 参照方法来自于：Acosta-Mart?′Nez V, Tabatabai M A. Arylmidase Activity of Soils [J]. Soil Science Society of America Journal, 2000, 64：215-221 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 N- acetyl-β-D-glucosaminidase （NAG，EC 3.2.1.52） 醋酸钠 (CH3COONa·3H2O)4oC保存。此溶液被滴定到想要的pH,用之前先用蒸馏水稀释5倍。 2、底物p -Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide （10 mM）：0.342 g p -Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide（对硝基苯乙酰基氨基葡萄糖苷） 溶于100 mL醋酸盐缓冲液（0.1 M，pH 5.5），4oC保存。 3、氯化钙（CaCl2，0.5 M）：36.75 g CaCl2·2H2O溶于400 mL水中，定容至500 mL。 4、氢氧化钠（NaOH，0.5 M）：10 g NaOH溶于400 mL水中，定容至500 mL。 5、标曲对硝基酚（p-nitrophenol）溶液：1.000 g p-nitrophenol，溶于800 mL水中，定容至1L，4oC保存。（1000 ug/mL） 6、标准曲线绘制：吸取1 mL标准对硝基酚溶液，定容至100 mL（10 ug/mL）。吸取0，1，2，3，4，5 mL稀释的标准液，用蒸馏水补齐5 mL，浓度分别为0，10，20，30，40，50 ug 对硝基酚。 步骤： 称取1g 土壤于50 mL三角瓶，加入4 mL 0.1 M的醋酸盐缓冲液（pH，5.5）,1 mL 10 mM p -Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide，混匀，密封，37oC培养1 h。 培养结束后，加入 1 mL 0.5 M 的CaCl2和4 mL 0.5 M 的NaOH终止反应，过滤，然后在405 nm 比色。 无土对照只加试剂，无基质对照培养结束后在0.5 M 的CaCl2和4 mL 0.5 M 的NaOH终止反应后，再加入基质。 参照方法来自于：J.A. Parham, Deng S P. Detecti