环境微生物学教学生长量测定方法.ppt

细菌生长（数量）测定方法 （一）直接计数法（测微生物总数） 借助显微镜观察测定 1.涂片染色法 2.计数器(血球计数板）测定法 3.比例计数法 比例——样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例 4．比浊计数法 浊——细菌悬浮液的浊度 （1）制标准曲线（OD~No） （2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量 （二）间接计数法 (测定活菌数) 提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？ 繁殖 提问：细菌繁殖的可见现象是什么？ 产生菌落（固体培养基培养）、菌液混浊（液体培养基培养） 计数原理：一个细菌可繁殖成一个菌落或一群细菌. 缺点：慢 分固体培养法和液体培养法 一般计数平板的细菌生长菌落数以30~300个为宜。 2.稀释液体计数法 特点：液体培养、统计学查表计数 又称MPN法 （或最可能数法） Most Probable Number 例如测定SRB（硫酸盐还原菌，厌氧）的数量 提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？ 一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长（除非厌氧培养箱） (4)统计－查表－计算 根据不同稀释度变黑试管 ①统计出数量指标 三位数及其中最低稀释度 （取变黑的管数最多、稀释度又最低的生长管数，为第一位数字，后面两个稀释度的生长管数为后两位数） 提问：上例情况而言统计数量是几？ ②查表 表——MPN表 MPN三管法测数统计表 3.薄膜计数法 薄膜——微孔滤膜（φ0.45um） （3）统计计数 提问：假如 测出250个菌落，抽滤了50ml自来水，自来水中菌浓度是多少呢？ 250÷50ml=5个/ml自来水 样品中的细菌数量=菌落数÷抽滤样品的体积数 (三)重量法（测细胞的质量） 提问：已知什么条件通过测定细菌群体重量知道其数量？ 已知单个细菌的平均重量—— 除法计算 细菌的湿重量＝10-15~10-11g/个细胞 干重约为湿重的10％~20％。 2. 细胞含N量法 1. 干重法 悬浮物＝无机物+有机物（包括细菌） 提问：如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？ 高温(550℃)灼烧 （1）悬浮物中绝大多数为细菌时 细胞数目=MLSS÷个体细菌的平均干重量 （2）除细菌外还有大量无机悬浮物时 W无 MLVSS挥发性悬浮物＝MLSS － W无 =细菌群体的干重量 细胞数目= MLVSS÷个体细菌的平均干重量 （3）有大量非细菌有机悬浮物时 提问：如何测定呢？ 不能用重量法，应改用其他方法。 总体来说重量法方法误差较大，一般只作为菌数粗略估算 如活性污泥测定（以重量MLSS、MLVSS间接表示细菌数量） 提问：当你需要测定某水样中细菌数量时，你该如何选择方法？ * * 优点：快速 提问:有哪些缺点? 缺点：不能区分细菌的死活 分四种 1视野菌液(ml)＝(0.01ml ／1cm2)*视野面积(cm2) 0.052cm2×25 0.1ml菌液 提问：数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少？ (90个÷125) * 400 / 0.1ml =2880个/ml 适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物 细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。 数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数125个小格），折算样品细菌浓度； 提问：如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？ 5.5×400万个/m l =2.2×107个/mL样品 红血球数已知(男性400~500万个／ml，女性350~450万个／ml)，平均400万个/ml 细菌 红血球 提问：如何定量二者关系呢？ 细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比 浊度仪或721分光光度仪 无菌水 1. 稀释平板计数法—固体培养法 第一步：菌样巧妙稀释 得到不同稀释度 （10-x）菌液 菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图 10 - 2 10 -3 10 -4 10 -5 各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。 第三步：培养 稀释度过低，菌落密集无法计数 可以计数，但数量过多，费时费力 数量合适，统计计算，作为结果 数量太少，误差因素太大，不做计数 第二步：接种平板 每一个细菌会生成一个菌落 第四步： 计数 细菌数量=？ 细菌数量=数出的菌落数/稀释度 例如：10