细胞分子生物学技术doc.doc

1普通细胞化学与酶细胞化学区别与联系 细胞化学是研究细胞的化学成分，在不破坏细胞形态结构的状况下，用生化的和物理的技术对各种组分做定量的分析，研究其动态变化，了解细胞代谢过程中各种细胞组分的作用，是在细胞活动中的变化和定位的学科。 细胞化学是研究细胞的化学成分，及其在细胞活动中的变化和定位的学科。即在不破坏细胞形态结构的状况下，用生化的和物理的技术对各种组分做定量的分析，研究其动态变化，了解细胞代谢过程中各种细胞组分的作用。 细胞化学对酶的研究一般是将薄的冰冻切片用适宜的底物温育，然后来测定酶在细胞内的位置 酶细胞化学技术 HYPERLINK /view/javascript:void(0) : 将细胞内的 HYPERLINK /view/1326.htm \t /view/_blank 酶与 HYPERLINK /view/63162.htm \t /view/_blank 底物相互作用， 再将酶反应的产物作为反应物质，在酶的作用部位进行捕捉，使其在显微镜下具有可见性。这种在酶作用下产生反应产物， 经捕捉反应来间接证明酶定位的反应称为酶的细胞 HYPERLINK /view/50843.htm \t /view/_blank 化学反应。 酶细胞化学反应实际上就是孵育反应的过程，孵育液的成分主要有酶的底物、捕捉剂，保证孵育液 HYPERLINK /view/307864.htm \t /view/_blank pH的缓冲液以及有关的添加剂等。孵育的温度和时间可根据不同的酶和组织通过实验而确定。电镜酶细胞化学的样品在孵育反应后需经锇酸后固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋和超薄切片，至电镜下观察。 基本实验过程 光镜样品： 固定（酶固定+结构固定）→ 冷冻切片 → 细胞化学反应 （酶反应+捕捉反应）→ 光镜观察 电镜样品： 固定（酶固定+结构固定）→切组织片→细胞化学反应 （酶反应+捕捉反应）→脱水包埋→ 超薄切片→电镜观察 2.为什么选用幼龄动物组织或胚胎进行细胞培养 细胞分化程度低，增殖能力强，更易于培养 3、如何实现一个人的基因在e.coli中的表达?简述其实验步骤?? 利用含有携带外源目的基因表达载体的E.coli表达菌株，通过向细菌培养基中加入化学试剂或是通过温度等条件的诱导（根据所构建的表达载体确定，不同载体构建中所用启动子不同，诱导表达方式也不一定相同），可使外源基因在E.coli中高效表达。 首先提取你要的目标的mRNA，然后做 HYPERLINK /s?wd=%E5%8F%8D%E8%BD%AC%E5%BD%95PCRhl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 \t /_blank 反转录PCR，设计 HYPERLINK /s?wd=%E5%BC%95%E7%89%A9hl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 \t /_blank 引物的时候注意 HYPERLINK /s?wd=%E4%B8%8A%E6%B8%B8%E5%BC%95%E7%89%A9hl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 \t /_blank 上游引物要包含 HYPERLINK /s?wd=%E5%90%AF%E5%8A%A8%E5%AD%90hl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 \t /_blank 启动子和下游 HYPERLINK /s?wd=%E5%BC%95%E7%89%A9hl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 \t /_blank 引物要包含 HYPERLINK /s?wd=%E7%BB%88%E6%AD%A2%E5%AD%90hl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 \t /_blank 终止子，这样才能获得完整的 HYPERLINK /s?wd=%E7%BC%96%E7%A0%81%E5%BA%8F%E5%88%97hl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 \t /_blank 编码序列。 然后你需要将你的 HYPERLINK /s?wd=%E5%8F%8D%E8%BD%AC%E5%BD%95PCRhl_tag=textlinktn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 \t /_blank 反转录PCR产物进行 HYPERLINK /s?wd=%E5%BA%8F%E5%88%97%E6%B5%8B%E5%AE%9Ahl_tag=textlinktn=SE_hldp01350