蛋白质的检测和分离.pptx

第1页/共259页蛋白质的检测和分离第2页/共259页第一节 引言第二节 前处理第三节 蛋白质的粗分离第四节 蛋白质的层析分离第五节 蛋白质的电泳分离第六节 蛋白质的结晶第七节 蛋白质的检测 第3页/共259页第一节 引言一、蛋白质的存在蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。一般蛋白质，酶、抗体、激素蛋白、毒素蛋白等存在部位器官、组织、体液胞内、胞外第4页/共259页一、蛋白质的存在存在形式游离状态 消化液中的蛋白结合状态 蛋白与蛋白 蛋白与非蛋白第5页/共259页二、为什么要分离提纯蛋白质?1、农业生产的需要(1)对农副产品的综合利用需要高活性的酶制剂。(2)用酶分析法测定家畜家禽以及农作物中某种物质的含量，需要用高纯度的酶制剂。 第6页/共259页二、为什么要分离提纯蛋白质?2、工业生产的需要食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、葡萄糖异构酶第7页/共259页二、为什么要分离提纯蛋白质?3、医疗上的需要人尿激酶治疗脑血栓用猪心细胞色素C治疗脑震荡心力衰竭用猪胰岛素治疗糖尿病第8页/共259页二、为什么要分离提纯蛋白质?4、蛋白质结构与功能研究及基因工程研究的需要均一的蛋白制剂工具酶高纯度的标准蛋白第9页/共259页三、对蛋白质分离提纯的要求1、纯度决定于研究的目的和应用上的要求2、活性要求蛋白质保持天然构象状态，有高度的生物活性3、收率收率越高越好提纯步骤愈多，则损失愈大作为均一制剂，一般收率在5-20％，最高可以达到50％左右。第10页/共259页四、蛋白质分离提纯的一般程序 准备工作： 1、选材，处理；2、建立适当的细胞破碎和蛋白质抽提方法；3、建立一系列的分离提纯和浓缩的方法；4、建立灵敏而方便的分析方法，以估计每一个分离提纯步骤的提纯倍数和收率；5、建立鉴定纯度的方法(如：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等)，以鉴定蛋白质制剂的纯度。第11页/共259页四、蛋白质分离提纯的一般程序蛋白质分离提纯的四个阶段：第一阶段(前处理)：选材，破碎，抽提，离心分离，得无细胞抽提液。胞外蛋白不须细胞破碎。第二阶段(粗分级)：根据不同蛋白质的溶解度差异，采用适当的沉淀法，对所需蛋白质进行初步的分离提纯。如：盐析法、等电点法、有机溶剂沉淀法、选择性变性法，以及选择性沉淀法等。适合于处理大量的样品溶液。第12页/共259页四、蛋白质分离提纯的一般程序第三阶段(细分级)：经过粗分离得到的蛋白质制剂是不纯的细分级可以采用适当的柱层析法。如：离子交换柱层析(DEAE-纤维素、CM-纤维素)、分子筛层析(Sephadex)、吸附层析(羟基磷灰石)、疏水吸附层析、亲和层析、抗原抗体法等。柱层析法对蛋白质的分离提纯效果很好，但不能处理大量的样品溶液制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳，或蔗糖密度梯度等电聚焦法进一步提纯。此二法只能处理少量样品，所以在提纯的后期使用，比较合适。采用结晶法对蛋白质进一步提纯。蛋白质制剂必须达到较高纯度才能进行结晶。所以，结晶法是在提纯的后期使用的。第13页/共259页四、蛋白质分离提纯的一般程序第四阶段(质量鉴定)：纯度、浓度SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦法、超离心沉降法、免疫电泳法、酶活力法、蛋白质化学结构分析法等。一般需要用两种或更多的方法鉴定蛋白质制剂的纯度。经常使用Folin-酚法，双缩脲法、紫外吸收法考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度。酶需要测定比活力及酶溶液的蛋白质浓度。第14页/共259页四、蛋白质分离提纯的一般程序防止蛋白质变性的措施：1、低温(0℃一4℃)操作，防止热变性和蛋白水解酶水解。2、严格控制pH值，防止过酸过碱对蛋白质的变性作用。3、搅拌要缓慢，防止泡沫表面张力引起蛋白质变性。第15页/共259页四、蛋白质分离提纯的一般程序防止蛋白质变性的措施： 4、防止蛋白质自发变性，可以采取下列措施：(1)加入低分子量物质(如蔗糖和甘油等)或加入纯化的蛋白质(如牛血清白蛋白、明胶等)，以提高蛋白质浓度，减少水的伤害。(2)少数蛋白质必须在高离子强度的极性介质中才能保持活性，可以加KCI，或NaCl，(NH4)2SO4。(3)有的蛋白质需要加入二价金属离子(如Mg2+、Ca2+等)才能保持稳定性。(4)某些酶的提纯和保存，需要加入底物，才能稳定。第16页/共259页四、蛋白质分离提纯的一般程序需要额外注意的两个问题：天然构象的保持多亚基多功能寡聚酶第17页/共259页第二节 前处理 一、材料的选择二、细胞破碎三、抽提第18页/共259页第二节 前处理 一、材料的选择选材的原则是：(1)材料中所需蛋白质的含量要高；(2)材料易得。第19页/共259页一、材料的选择材料中蛋白质含量的多少与下列因素有关：种属差异，如