蛋白质-3-蛋白质分离技术.ppt

Chapter2蛋白质;Chapter2蛋白质;2.6蛋白质的别离、纯化;;

研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。

(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；

(2)别离和纯化过程都必须0－4℃的低温下进行。;1．蛋白质的别离步骤;2．蛋白质的纯化方法;透析法;2．蛋白质的纯化方法;凝胶过滤原理当不同大小的蛋白质颗粒流经凝胶柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。;;凝胶过滤层析;;蛋白质分子一般有两种形状，一种是球形分子，另一种是线性分子。线性蛋白质分子与球形分子比较，同样大小分子量的蛋白质，线性分子体积大流速快，球形分子体积小流速慢。因此，在凝胶色谱柱中无论是球形分子还是线性分子都可进行别离，但球形分子比线性分子的别离度好。;此法是利用离子交换剂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行别离的方法。

离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂〔如羧甲基纤维素等〕，阴离子交换树脂〔如二乙基氨基乙基纤维素等〕。

带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合那么较弱。

用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，或是改变流动相的PH值，或是同时采用这两种方法，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行别离。;;离子交换层析;;这是一种高效别离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。

选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。

将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质那么流出柱外。

被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液或高盐溶液洗脱。;;+;;;;(1)原理：

a.蛋白质分子状态

在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大??子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子。在电场下向自身电荷相反的方向移动。;b.复原剂的解聚作用

在蛋白溶液和别离凝胶介质中参加复原剂—?-巯基乙醇(?-mercaptoethanol)或二硫苏糖醇(Dithiothretiol,DTT)。蛋白质分子在复原剂作用下二硫键被复原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键翻开，形成长短不一的单链亚基。;c.SDS的包裹作用

SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形成的氨基酸侧链与SDS结合，在SDS的重量到达蛋白重量的3-4倍时蛋白质分子外表完全被SDS包裹，形成带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质-SDS复合物(protein-SDSmicelles)。

由于蛋白质-SDS复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。;;;(2)操作过程

制胶?加样?电泳?固定?染色?脱色?计算

;(3)结果处理

a.电泳图谱;b.标准曲线

绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数log(M)为纵坐标，Rf值为横坐标，绘制标准曲线。;(4)影响因素

影响SDS-复合物形成的主要因素。SDS-电泳成败关之一，是在制备样品的过程中，蛋白质与SDS结合的程度直接影响电泳别离效果。影响结合的因素主要有三个:

A.溶液中SDS单体的浓度

SDS在水溶液中以单体和SDS复合物混合存在的，能与蛋白质结合的只能是单体。单体的浓度与SDS总浓度，温度和离子强度有关。在一定温度和离子强度下，SDS处于一饱和值，即单体浓度不再随SDS中浓度增加而增加。为了使SDS与蛋白质结合充分，SDS和蛋白质结合的重量比一般是4:1或3:1。;B.样品缓冲液离子强度

因为SDS结合到蛋白质分子上的量取决于平衡时SDS单体浓度，而不是总浓度，只有在较低的离子强度溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度，所以样品缓冲液应选用低离子强度，通常是10-100mmol/l之间。

C.二硫键是否完全翻开

只有蛋白质分子中的二硫键完全被翻开，蛋白质分子完全解聚，SDS充分与亚基分子结合，才能准确测定出亚基分子量。二硫键完全被翻开要取决于巯基乙醇的质量和使用的剂量。假设蛋白质分子的二硫键只是局部被翻开，这是测出的分子量是蛋白质分子和亚基分子的混合物。;;

b.蛋白质与两性电解质

(1)蛋白质的等电点

蛋白质