实验二十食品中黄曲霉毒素B1的检测.ppt

实验二十、食品中黄曲霉毒素B1的检测 标准依据: GB/T5009.22-2003食品中黄曲霉毒素B1的测定 一、实验目的与要求： 1、学习酶联免疫(ELISA)方法测定粮食及食品中黄曲霉毒素B1的实验原理，掌握实验的操作要点及测定方法 2、了解酶联免疫(ELISA)的工作原理，正确熟练使用酶标仪。 二、实验原理： 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准曲线比较测定含量。 三、仪器与试剂 （一）试剂盒组成 1、 AFB1抗原包被16孔×6条形带框酶标板； 2、抗体； 3、酶标二抗； 4、空白对照液； 5、底物（1mg×4）； 6、底物液A； 7、底物液B； 8、终止液； 9、PBS一T洗液； 10、一次性手套。 （二）仪器 1、酶标仪； 2、离心机。 四、实验步骤 （一）样品中AFB1的提取 1． 大米和小麦（脂肪含量＜3.0％）： 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250m1具塞锥形瓶中。准确加人60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中，立即取12mL滤液（相当4.0g样品）于75mL蒸发皿中。65℃水浴通风挥干。用2.0mL甲醇一PBS (20+80)分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。 2. 玉米（脂肪含量3.0～5.0％）： 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中,待分层后，放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯内，从中取10.0mL （相当于4.0g样品）于75mL蒸发皿中,以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 3．花生（脂肪含量15.0－45.0％）： 样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加人100.0mL甲醇水(55 ＋45）溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于100mL烧杯内，从中取20.0 mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）．放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一并于蒸发皿中，以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 4．植物油： 用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇水(55 ＋45）溶液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼油4.0g样为4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再加溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层甲醇水溶液于750mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下按自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 5．其它食品：可按照G8 5009有关章节提供的方法操作，最终提取物（相当于4.0g样 品）应收集于2.0m1甲醇一PBS(20＋80)中。 （二）样品测定 1、将下列试剂稀释后备用 PBS一T洗液：390mL蒸榴水稀释（1:40）； 底物液A: 9mI蒸溜水稀释（1:9）； 抗体: 7.0mL洗液稀释（1:140）； 酶标二抗:10mL洗液稀释（1:200）； 阴性对照液:200μl抗体十200μl空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置。 2、抗体抗原反应 将抗体与等量样品提取液（溶液为甲醇一PBS）在玻璃试管内混合振荡后室温 静置15分钟。启封酶标板，用洗液2×3分钟洗板后在吸水纸上拍干，分别在适当孔位加入此抗体抗原反应液及空白对照液（3孔）和阴性对照液（3孔）,130μl／孔,37℃湿盒中孵育（或加盖以保持相对湿度），2小时后，倒掉反应液并拍干,用洗液3×3分钟洗板，拍干。 3、酶标记反应 加入酶标二抗，100μl／孔，37℃盒中孵育1小时后，用洗液5×3分钟洗板，拍干。 4、显色反应 lmg底物十2.5m1底物液A ＋42μl底物液B，待底物充分溶解后加入酶标板，100μl／孔，37℃15分钟后加终止液40μl／孔。 5、测定 酶标仪490nm测定各孔0.D值。 五、数据处理及计算结果 1、求出各孔的0.D校正值：0.D校正值＝O.D实测值一空白对照孔0.D值（均