实验二十食品中黄曲霉毒素B1的检测.ppt
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实验二十、食品中黄曲霉毒素B1的检测 标准依据: GB/T5009.22-2003食品中黄曲霉毒素B1的测定 一、实验目的与要求: 1、学习酶联免疫(ELISA)方法测定粮食及食品中黄曲霉毒素B1的实验原理,掌握实验的操作要点及测定方法 2、了解酶联免疫(ELISA)的工作原理,正确熟练使用酶标仪。 二、实验原理: 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法,样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应,多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合,加入酶标记物和底物后显色,与标准曲线比较测定含量。 三、仪器与试剂 (一)试剂盒组成 1、 AFB1抗原包被16孔×6条形带框酶标板; 2、抗体; 3、酶标二抗; 4、空白对照液; 5、底物(1mg×4); 6、底物液A; 7、底物液B; 8、终止液; 9、PBS一T洗液; 10、一次性手套。 (二)仪器 1、酶标仪; 2、离心机。 四、实验步骤 (一)样品中AFB1的提取 1. 大米和小麦(脂肪含量<3.0%): 样品粉碎后过20目筛,称取20.0g,加入250m1具塞锥形瓶中。准确加人60mL三氯甲烷,盖塞后滴水封严,150rpm振荡30min。静置后,用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中,立即取12mL滤液(相当4.0g样品)于75mL蒸发皿中。65℃水浴通风挥干。用2.0mL甲醇一PBS (20+80)分三次(0.8mL、0.7mL、0.5mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物,移至小试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。 2. 玉米(脂肪含量3.0~5.0%): 样品粉碎后过20目筛,称取20.0g,加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入50.0mL甲醇一水(80+20)溶液和15.0mL石油醚,盖塞后滴水封严,150rpm振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中,待分层后,放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯内,从中取10.0mL (相当于4.0g样品)于75mL蒸发皿中,以下按上述“65℃水浴通风挥干”起,依法操作。 3.花生(脂肪含量15.0-45.0%): 样品去壳去皮粉碎后称取20.0g,加入250mL具塞三角瓶中,准确加人100.0mL甲醇水(55 +45)溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封严,150rpm振荡30min,静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中,待分层后,放出下层甲醇水溶液于100mL烧杯内,从中取20.0 mL(相当于4.0g样品)置于另一125mL分液漏斗中,加入20.0mL三氯甲烷,振摇2min,静置分层(如有乳化现象可滴加甲醇促使分层).放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中,再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后,放出三氯甲烷层一并于蒸发皿中,以下按上述“65℃水浴通风挥干”起,依法操作。 4.植物油: 用小烧杯称取4.0g样品,用20.0mL石油醚,将样品移于125mL分液漏斗中,用20.0mL 甲醇水(55 +45)溶液分次洗烧杯,溶液一并移人分液漏斗中。(精炼油4.0g样为4.575mL,可直接用移液器加入分液漏斗再加溶剂后振摇)振摇2min,静置分层后,放出下层甲醇水溶液于750mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇水溶液重复振摇提取一次,提取液一并加入蒸发皿中,以下按自“65℃水浴通风挥干”起,依法操作。 5.其它食品:可按照G8 5009有关章节提供的方法操作,最终提取物(相当于4.0g样 品)应收集于2.0m1甲醇一PBS(20+80)中。 (二)样品测定 1、将下列试剂稀释后备用 PBS一T洗液:390mL蒸榴水稀释(1:40); 底物液A: 9mI蒸溜水稀释(1:9); 抗体: 7.0mL洗液稀释(1:140); 酶标二抗:10mL洗液稀释(1:200); 阴性对照液:200μl抗体十200μl空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置。 2、抗体抗原反应 将抗体与等量样品提取液(溶液为甲醇一PBS)在玻璃试管内混合振荡后室温 静置15分钟。启封酶标板,用洗液2×3分钟洗板后在吸水纸上拍干,分别在适当孔位加入此抗体抗原反应液及空白对照液(3孔)和阴性对照液(3孔),130μl/孔,37℃湿盒中孵育(或加盖以保持相对湿度),2小时后,倒掉反应液并拍干,用洗液3×3分钟洗板,拍干。 3、酶标记反应 加入酶标二抗,100μl/孔,37℃盒中孵育1小时后,用洗液5×3分钟洗板,拍干。 4、显色反应 lmg底物十2.5m1底物液A +42μl底物液B,待底物充分溶解后加入酶标板,100μl/孔,37℃15分钟后加终止液40μl/孔。 5、测定 酶标仪490nm测定各孔0.D值。 五、数据处理及计算结果 1、求出各孔的0.D校正值:0.D校正值=O.D实测值一空白对照孔0.D值(均
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