树突状细胞释放外排体的方式影响间充质干细胞增殖.doc

精选公文范文管理资料 [键入文字] [键入文字] [键入文字]树突状细胞释放外排体的方式影响间充质干细胞增殖 　　外排体(Exosome)是由多种细胞的胞内体衍生而来,通过出芽方式释放到细胞外的一种脂质双层膜性结构〔1〕,大小为40~100nm。由于其携带母细胞成分已逐渐被认为是细胞间进行信息交流,从而产生相互作用的新方式。树突状细胞(DC)作为一种体内分布广泛、最强的抗原提呈细胞,在成熟的过程中可产生外排体(DCex)。DCex除表达一些 非特异性抗原外,还 表 达MHC-Ⅱ类 分 子、CD83、CD86、CD80等免疫抗原,许多研究证实其具有激活免疫反应、抗肿瘤的作用〔2〕。近年来,越来越多的研究表明DCex也具有诱导免疫耐受的功能〔3〕。因此,由于DCex的免疫调节功能和其本身的稳定性、易获得性,已在肿瘤治疗、诱导移植耐受和治疗自身免疫性疾病中引起广泛关注。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一种来源于中胚层、成纤维样贴壁生长的细胞,因其具有多向分化潜能、免疫调节和分泌细胞因子的能力,已成为研究治疗免疫疾病和组织修复等的重要手段。 　　MSC可调节多种免疫细胞的功能,其中DC是MSC免疫调节作用中重要的效应细胞,其重要性已经在MSC应用于造血干细胞移植的临床试验中得到证实。然而,细胞间的调节可能是双向的,在MSC影响DC成熟及发育的同时,DC是否也对MSC能产生作用,目前尚未见到相关报道。本文将主要在体外进行探 讨DC是 否 可 以 通 过 释 放DCex的方式对MSC增殖产生影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　人骨髓标本来自于空军总医院血液科健康供者,标本采集经医院伦理委员会要求执行;人淋巴细胞分离液Ficoll(1.077g/ml)购于天津灏洋生物制品科技有限公司;α-MEM、RPMI-1640基础培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自Hy-clone公司;重组人粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、重组人白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)均购于北京新明力泰生物科技有限公司;脂多糖(LPS)、MTT购于美国Sigma公司;CFSE染料购于北京碧云天生物科技有限公司;PE或FITC标记的鼠抗人CD83、CD86、CD80单抗、Per-cp标记的HLA-DR单抗购自于美国BD公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 人骨髓MSC的分离、培养及鉴定实验室骨髓标本取自骨髓移植健康供者,经知情同意以及医院伦理委员会批准后采集。细胞分离、培养及鉴定按本 实 验 室 常 规 方 法 进 行〔4-6〕。将 骨 髓 液 用PBS以1︰1的比例稀释后沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液(Ficoll液)上,以2 000r/min离心30min,吸出白膜层细胞,即为单个核细胞。 　　PBS洗涤2次后接种于含10%FBS的α-MEM培养液中,经72h后去除非贴壁细胞,更换新培养液。以后每3天更换新鲜培养液。当细胞80%~90%融合时,胰蛋白酶消化传代。取P3代细胞进行流式鉴定和诱导分化功能鉴定,细胞高表达CD44和CD73,不表达CD31和CD45。此外,细胞具有体外成脂和成骨分化能力。取第3~5代细胞用于实验。 　　1.2.2 人骨髓来源DC的培养及鉴定同上分离得到单个核细胞,按2×106/ml细胞密度接种于含10%FBS的RPMI-1640培养液中,静置于37℃、5%CO2孵箱。2h后去除非贴壁细胞,更换为含GM-CSF 1 000 U/ml、IL-4 500 U/ml的培养液。隔天半量换液。第5天加TNF-α1 000U/ml促进DC成熟。48h后收集细胞进行流式鉴定。 　　1.2.3 DCex的制备按Théry等〔7〕方法,DC经LPS(10ng/ml)刺激24h后收集培养上清,3 500r/min离心10min去除细胞大碎片,继续过0.22μm滤膜以去除更小碎片,将上清液加入超离管中,在4℃、绝对平衡的条件下超速离心(100 000r/min,1h)后倒掉上清液,PBS重悬后再次超速离心,收集DCex。将DCex分装后-80℃保存待用。 　　1.2.4 DCex电镜观察及表面分子检测吸取15μl上述步骤中提取的DCex悬液,滴于铜网上,静置2min后用滤纸慢慢吸干,加20μl磷钨酸于铜网上负染2min后滤纸吸干,PBS洗涤1次,白炽灯下烤20min后放于电镜下观察。应用乳胶珠子(Beads)结合法检测DCex携带抗原。将0.1μgBeads(105个左右)加入1.5 ml离心管中,MESbuffer离心洗涤2次,重悬于MES buffer中,加入5μg DC