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第四章 DNA重组技术 第一节 分子克隆中所用的酶 一 限制性内切酶（Restriction endonuclease） 定义：特异性地结合在一段特殊DNA序列之内或附近，并在此处切割双链DNA的一类核酸内切酶。 2 识别和断裂（recognition and cleavage） 识别序列的长度都为4-6个base paires，将磷酸根给了5ˊ-OH，得到5ˊ-P，3ˊ-OH。断裂的末端： 形成平头末端（blunt terminus end） 得到5ˊ的突出末端（5ˊ-protruding end） 得到3ˊ的突出末端（3ˊ-protruding end） 3 特殊的Ⅱ类RE： 同裂酶（Isoschizomer） 把许多来源不同，但可切割同一靶序列的限制酶，即所识别的位点中有相同的碱基序列。如：HpaⅡ和MspⅠ 5ˊ…C ↓ CGG…3ˊ，可用来分析甲基化位点。 ②Subset酶 识别与切割序列相互有关的酶：如：Mbo I 5ˊ…↓GATC BclI 5ˊ…T↓GATCA BamHI 5ˊ…G↓GATCC SmaI 5ˊ…CCC ↓GGG Hpa Ⅱ 5ˊ…CC↓ GG ③远距离裂解酶：断裂住点在识别序列后端几个到10几个bp。如：MboⅡ GAAGA（8/7）后第8个或第7个核苷酸处有切口。 ④可变酶：在所识别的序列中有少数碱基是可以改变的。 如：Acc I3 其含义为：Acc I 所识别的序列为GT↓（ AC ）（ GT）AC，即Acc遇到下列四种序列均可降解：GT↓ AGAC，GT↓ATAC，GT↓CGAC，GT↓CTAC。 ４RE的活力和质量： 活力：在适当反应条件下，一个小时内完全水解lug DNA所需的酶量。 质量鉴定： ①过夜消化实验：长时间把DNA在酶的水解中，以不出现新的DNA片断为标准。 ②用重连DNA片断再次水解，水解产物电泳结果没有新的带型改变。 5酶解体系的建立： 标准体系：在50ul体系中，1个单位的酶水解1ug的DNA，在厂家推荐的反应条件中进行。 星号活力：指限制性内切酶在非标准条件下能切割一些与特殊序列相似的序列位点。也就是说，专一性降低，产生一些DNA片断。 底物位点优势：指限制性内切酶对DNA中相同序列的不同识别位点，切割速率不同的现象，其原因可能与DNA的三级结构有关。 二 甲基化酶 dam甲基化酶：此酶可在5ˊGATC 3ˊ序列中A N6位置上引入甲基→m16A。此位点的酶有：PvuⅡ、BamHⅠ、BclⅡ、XhoⅡ、MboⅠ。 dcm甲基化酶：此酶在序列5ˊCCAGG 3ˊ中的胞嘧啶C5的位置上引入甲基→m15C。受dcm甲基化作用影响的酶是EcoRⅡ。 甲基化酶的用途： 1.保护目的基因。 2.改变限制性内切酶的表现特异性。有些酶对甲基化后的位点不敏感，有的RE专切甲基化后的位点。 三 连接酶（Ligase） T4 DNA连接酶：从T4噬菌体感染大肠杆菌中分离出来，由T4噬菌体DNA所编码，分子量6.8万Dolton。催化DNA 5ˊ磷酸基与3ˊ羟基之间形成磷酸二酯键。 用途： 1.连接粘性末端的双链DNA（cohesive ended dsDNA）。 2.连接平端双链DNA（blunt dsDNA）和缺口双链DNA（nick dsDNA）。 2 .T4RNA连接酶 可催化ssDNA or ssRNA，仍要求3ˊ-OH，5ˊ-P。 将单链核酸连在一起，能把小分子单链做为有效底物。 用途：1.激活T4 DNA连接酶的活性。 2.标记3ˊ末端。 3. 大肠杆菌DNA连接酶 可催化含互相匹配5ˊ突出端和3ˊ突出端的dsDNA之间形成磷酸二酯键，需NAD+作为辅因子参与催化。在PEG或Ficoll（聚蔗糖）存在下，可催化平端连接。PEG和Ficoll起体积占据剂的作用。 四 DNA polymerase 1 大肠杆菌DNA polymeraseⅠ： 由单条多肽链组成。MW：10.9 KD。 活性：1. 5ˊ→3ˊ聚合活性。2. 3ˊ→5ˊ和5ˊ→3ˊ外切活性。3有RNase H活性。RNase H是大肠杆菌存在所必需的。 用途： 1.合成cDNA的第一条链。 2 .标记 a 均匀标记：用切口平移法标记DNA；b 标记3ˊ-end（交换反应、置换反应）。 2 Klenow fragment（大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断） ?是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA polymeraseⅠ而产生或通过克隆技术而得到的单一多肽链。MW：7.6KD。 ?活性：5ˊ→3ˊ聚合功能和3ˊ→5ˊ外切活性