southern杂交标准步骤.doc

试剂的选用和配置： 不同种类的尼龙膜其所采用的转移缓冲液和洗膜液不同。 本实验标准采用带正电荷的尼龙膜。 变性液/碱性转移缓冲液（应用于带正电荷尼龙膜的碱性转移） 0.4mol/L NaOH 1mol/L NaCl 配2×母液1L。 中和缓冲溶液Ⅱ（只用于碱性转移） 0.5mol/L Tris-Cl (pH 7.2) 1mol/L NaCl 20×SSC 800ml H2O溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，用几滴14mol/LHCl调pH至7.0，用水定容至1L。分装后高压灭菌，试剂终浓度为3.0mol/L NaCl和0.3mol/L柠檬酸钠。 10%(m/V) SDS 配制时68℃加热助溶，浓盐酸调pH至7．2，定容室温保存。（pH极易调过，需小心！） 二、技术操作步骤： Ⅰ、DNA酶切和低压电泳： 概述：酶切所需DNA的量为10μg～30μg，所需限制性内切酶量为10Unit酶/1μg DNA，neb公司的限制性内切酶的最佳酶切条件为50μl体系酶切1～2μgDNA。为了避免型号活性，注意所加酶的甘油含量和盐分含量（glycerol concentration 5%, or pH 8.0 may result in star activity酶储液含50% glycerol，因而酶最大用量不能超过酶切体系的10%），同时，选择内切酶时要注意其可能因甲基化的敏感性导致基因组酶切效果不好。 1、400μl的酶切反应体系：（10～30μg） 30 μg DNA 酶300 U 37℃酶切16h。电泳检测酶切效果。1/10体积（40μl）3mol/L醋酸钠2.5倍体积的冷无水乙醇（或0.6～1倍体积的遇冷异丙醇）-20℃沉淀DNA，70%乙醇洗涤沉淀，溶解于25μl 1×TE。 2、荧光定量测定浓度后，加入5μl 6×上样缓冲溶液，56℃水浴5min，迅速置于冰上2min，以破坏粘性末端可能形成的碱基对。1×TAE或0.5×TBE电泳缓冲液和0.8%的琼脂糖凝胶以小于1V/cm的电压电泳12h。由于DNA在凝胶中会扩散，因而最好不要将凝胶放置超过一天。（楼下电泳仪一般用30V） 3、修去凝胶边缘和加样孔上不平整的无用部分，加样孔端朝下，凝胶左下角Marker侧，切去一小三角，作为凝胶方位的标记。 对于大于15kb的条带，可采用将凝胶置于0.2mol/L的HCl中数分钟，直到溴酚蓝变黄，二甲苯青变成黄色/绿色后，迅速将HCl倒入废液缸，去离子水洗涤数次。（强酸导致DNA脱嘌呤，而有利于转膜。但是，过度会导致DNA断裂成较小片段。） Ⅱ、DNA的变性、转膜装置组装和转膜： 1、带电荷的尼龙膜： 将凝胶浸入数倍体积的碱性转移缓冲溶液中，室温振荡15min。 更换一次碱性缓冲溶液继续浸泡20min。 2、切一张每边比凝胶大1mm的尼龙膜，并剪两张同样大小的厚吸水纸。（注意：需带一次性PE手套和钝头镊子，沾有油污的膜不易浸湿。） 3、将膜飘浮于盛有去离子水的平皿中，直到其完全浸湿后，将其浸入适当的转移缓冲溶液中至少5min，用干净的解剖刀切下膜的一角，与凝胶所切下的角一致。（注意：膜的浸湿完全与否，对DNA的转移至关重要。浸湿的膜可保存在高压的2×SSC饱和的3MM滤纸中，4℃保存。） 4、将一张厚的吸水纸放在一片树脂玻璃板或平皿上，形成比凝胶长且宽的支持物。将支持物或皿放入一个大的干烤皿中，吸水纸两端从板边缘垂下。 5、干烤皿中加入适当的转移缓冲液，直到液面几乎与支持物表面平齐。当支持物上的吸水纸完全浸湿后，用玻璃棒赶走吸水纸下的气泡。 6、将凝胶从变性液/碱性缓冲液中取出，倒转使原来的底面向上。放在支持物上，并位于吸水纸中央。用玻璃棒赶走凝胶与吸水纸间的气泡。 7、用Parafilm膜包绕凝胶四周，不要覆盖凝胶。以屏蔽转移缓冲液从凝胶周围短路流入吸水纸。 8、用适当的转移缓冲溶液将凝胶湿润。将湿润的尼龙膜放置于凝胶上并使两者的切角相重叠。为避免产生气泡，当先使膜的一角与凝胶接触再缓慢的将膜放到凝胶上。膜的一边应恰好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。膜一旦放在凝胶上就不要再移动了。 9、在尼龙膜上放置两张与膜大小相同的吸水纸，切一叠略小于吸水纸的纸巾（5～8cm高），将纸巾放在吸水纸之上，在纸巾顶部放一块玻璃板然后用一400g重物压实。 10、转移8～24h，当纸巾湿润后更换新的纸巾。 11、除去凝胶上的纸巾和吸水纸，翻转凝胶以及与之接触的尼龙膜，凝胶向上平放于干燥的吸水纸上。用极软的铅笔或圆珠笔标记加样孔的位置。 12、将凝胶从膜上剥离，弃去凝胶。 13、紫外成像检测凝胶上DNA的残留量，用以确定转移效率。 Ⅲ、DNA的固定： 带正电荷的尼龙膜的碱性转移： 碱性缓冲溶液会使DNA共价结合于带正电荷的尼龙膜上，因而不需要固定，