地高辛标记探针的Southern杂交技术.doc

地高辛标记探针的Southern 杂交技术 根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA退火形成双链结构。特定核苷酸序列的单链DNA或RNA在。DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图核酸杂交滤膜上常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。DNA或RNA分子滤膜上经过凝胶电泳分离通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的这个过程称为核酸印迹（nucleic acid blotting）转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dot and slot blotting）、菌落和嗜菌斑印迹法（colony and plaque blotting）；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。 1主要内容 1. Southern Blot方法的原理。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳。 3. DNA转移至硝酸纤维素膜/尼龙膜及膜处理。 4. 介绍随机引物法标记DNA探针，Southern blot的预杂交、杂交及显色过程。 2目的要求thern blot方法的原理；掌握随机引物法标记DNA探针，印迹法转移DNA至硝酸纤维素膜及膜处理。 3 实验原理 Southern杂交技术是由Edward M. Southern在1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交技术，并因此而得名。Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。。图 Southern blot印迹杂交原理示意图 （a）核酸内切酶消化的基因组 DNA；（b）琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段； （c）凝胶中的DNA谱带转移到硝酸纤维素滤膜上；（d）滤膜与标记的DNA分子探针杂交； （e）显显示杂交的DNA谱带。 Southern blot方法十分灵敏，在理想的条件下，用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2ng DNA也能被清晰地检测出来。 实验仪器： 尼龙膜；恒温水浴，塑料带，剪刀，平头镊子，封口机，烤箱，台式高速离心机，高压灭菌锅，电泳仪，水平电泳槽，微量移液器，摇床，吸水纸，3MM Whatman滤纸，干烤皿，玻璃平台等。 溶液配制 20 X SSC(1000 mL) : 组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠 Nal 175.32g 柠檬酸钠 88.26g NaOH调值到7.0， 洗涤缓冲液Washing buffer 200ml 组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20. ： 2.32g Nacl： 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调值7.5 马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml 组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20oC) ： 2.32g Nacl： 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调值7.5 检测缓冲液Detection buffer 100ml 组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20oC) Tris 1.21g, NaCl 0.584g MgCl2 1.01g 调ph值到9.5 变性溶液 (500 mL)：?1 molL NaCl (43.83 g)，?0.5 molL NaOH (10 g)， 中和溶液 (500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 molL NaCl (87.66 g)，用1 molL HCl调 5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris?6.9g硼酸0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL???? ??