第四章基因克隆的质粒载体详解演示文稿.ppt

（三）、质粒载体的构建与类型 1. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标 的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。 本文档共117页；当前第62页；编辑于星期六\13点5分 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个EcoR?酶切位点，一个四环素抗性选择记号（Tetr ），插入外源片段后不影响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。 本文档共117页；当前第63页；编辑于星期六\13点5分 ColE1质粒在其唯一的单切割位点EcoRl中克隆外源DNA片段后，可根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素E1的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。 本文档共117页；当前第64页；编辑于星期六\13点5分 2.理想的质粒载体必须具备的基本条件 (1) 具有复制起点 自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。 (2) 具有抗菌素抗性 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。 (3) 具有若干限制酶切单一位点（MCS） (4) 具有较小的分子量和较高的拷贝数 低分子量的质粒易于操作，克隆外源片段后仍能有效的转化给受体细胞，同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数，可获得大量的克隆基因。 本文档共117页；当前第65页；编辑于星期六\13点5分 以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。 （4363bp） 本文档共117页；当前第66页；编辑于星期六\13点5分 3.质粒载体的选择记号 新陈代谢特性； 对大肠杆菌素E1的免疫性； 抗菌素抗性； 四环素抗性、氨苄青霉素抗性、 链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因； 抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。 本文档共117页；当前第67页；编辑于星期六\13点5分 二、质粒载体的选择标记 抗菌素名称 作用方式 抗性机理 氨苄青霉素 干扰细菌胞壁的合成 产生β-内酰胺酶，破坏β-内酰胺环。 氯霉素 作用50S亚基，干扰蛋白合成。 产生乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化失活。 卡那霉素 作用70S亚基，导致mRNA错读。 产生的氨基糖苷磷酸转移酶，修饰卡那霉素。 链霉素 作用30S亚基，导致mRNA错译。 产生的特殊酶，修饰链霉素。 四环素 作用30S亚基，干扰蛋白合成。 产生的蛋白质对细菌的膜修饰，阻止四环素进入菌内。 本文档共117页；当前第68页；编辑于星期六\13点5分 4.不同类型的质粒载体 （1）高拷贝的质粒载体 克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因 （2）低拷贝的质粒载体 有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。 编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。 本文档共117页；当前第69页；编辑于星期六\13点5分 (3)失控的质粒载体 复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。 Example： pBEU1和pBEU2质粒，在30度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过35度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续2~3小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒DNA占细胞总DNA的50%。 本文档共117页；当前第70页；编辑于星期六\13点5分 (4)插入失活型质粒载体 将外源DNA片段插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。 Example： 在pBR329质粒载体的EcoR1位点插入外源片段，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片段的