单克隆抗体和基因工程抗体的制备.ppt

三、单克隆抗体的性质鉴定 鉴定的方法很多，用已知抗原测定抗体，几乎所有的抗原抗体反应试验都可以作，如阳性，再定量，确定工作浓度。 第三十一页，共六十八页，2022年，8月28日 第三节 基因工程抗体技术 杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、预防和蛋白质提纯应用中非常广泛，但对人是异源性，人抗小鼠抗体，应用基因工程技术减少小鼠源成分，保留原有的抗体特异性。 第三十二页，共六十八页，2022年，8月28日 一、人源化抗体 人源化抗体主要指鼠源性单克隆抗体的基因克隆及 DNA 重组技术改造，重新表达的抗体。其大部分氨基酸序列为人源序列所取代，既基本保留亲代鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了鼠异源性。 第三十三页，共六十八页，2022年，8月28日 （一）人-鼠嵌合抗体 通过基因工程技术将人 IgG C 区与鼠IgG V 区连接，导入细胞内表达制备的抗体称为嵌合抗体，因 IgG 的抗原性在 C 区，来自人，故抗原性降低，且半衰期明显延长，在介导 CDC 及 ADCC 亦明显增强。 第三十四页，共六十八页，2022年，8月28日 1.鼠单克隆抗体可变区基因克隆 用探针从该杂交瘤细胞的基因组文库中调取。用 PCR 方法从该细胞的 RNA 中扩增 VH 及 VL 基因。 第三十五页，共六十八页，2022年，8月28日 2. 表达载体的构建 人-鼠嵌合抗体的表达载体基因依可变区基因克隆的表达方式不同而分为两类，从基因文库所克隆的可变区基因带有上游的转录调控组件及内含子剪接信号，因此载体只需要包括细胞内增殖所必须的抗生素抗性基因和质粒复制的起始序列以及在真核细胞进行选择的显性标记基因。 第三十六页，共六十八页，2022年，8月28日 将载体 DNA 导入真核细胞称为转染。导入的 DNA 整合至细胞基因组 DNA 中得到转染子，要得到稳定的转染子需利用真核细胞的显性选择标记基因，这些标记基因使细胞获得对某些细胞毒物质的抗体，在培养液中加入相应的细胞毒物质可杀死转染不成功的细胞，达到选择的目的。 第三十七页，共六十八页，2022年，8月28日 3.表达 用哺乳动物细胞或大肠杆菌表达量较少，而应用二氢叶酸还原酶（dhfr）扩增系统使抗体表达增强。dhfr 是正常核酸代谢必须的酶，缺乏该酶的中华仓鼠卵细胞（ CHO））需在有次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷条件下利用 DNA 合成，因此, dhfr 作 CHO 的显性选择标记基因，在无次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情况下，只有导入 dhfr 基因，细胞才能存活。该糸统可用来扩增导入的目的基因。 第三十八页，共六十八页，2022年，8月28日 (二) 改形抗体（reshaped antibody,RAB） 应用基因工程技术在嵌合抗体基础上用人抗体可变区序列取代鼠源单抗CDR以外的骨架序列，重新构成既有鼠源单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体，该抗体对人无免疫原性。 第三十九页，共六十八页，2022年，8月28日 （三）抗体的表面修饰 人和鼠 IgV区来自不同的种属，轻链不同型别，互补性决定区(complementarity determining region,CDR) 的长度可不一致，但暴露于表面的AA残基的位置数量都很保守，通过改变表面残基使其人源化，降低鼠可变区的异源性，将Fv的表面人源化，消除其免疫原性而不影响 Fv 的整体空间构象。 第四十页，共六十八页，2022年，8月28日 （四）双特异性抗体 双特异性抗体（bispecific antibody,BsAb）又称双功能抗体。两个抗原结合部位具有不同的特异性，可以同时与两种不同特异性抗原发生结合。 第四十一页，共六十八页，2022年，8月28日 1.化学交联BsAb 分别分离纯化两种抗原的单抗，先使Ig解离后，获得单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来。该方法易致抗体失活，其产物也难以保证均质性。 第四十二页，共六十八页，2022年，8月28日 2.细胞工程BsAb 将二种杂交瘤细胞进行融合产生杂交瘤，核酸随机组合多种多样。 第四十三页，共六十八页，2022年，8月28日 3.基因工程BsAb 用抗体分子片段如ScFv或Fab等，经基因操作修饰后，或体外组装成为BsAb，或直接导入受体细胞表达分泌BsAb。 在免疫检