土壤中分解尿素的细菌的分离与计数导学案.doc

土壤中分解尿素的细菌的分离与激素 1、尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。 2、 CO(NH2)2 + H2O 细菌脲酶 CO2 +2NH3 一、研究思路 （一）筛选菌株 1、实例----耐高温DNA聚合酶的寻找 美国科学家布鲁克（1966年）--在美国黄石公园的一个热泉中发现耐热细菌。这说明寻找菌株要到期相应的 中寻找。 2、实验室中微生物的筛选原理 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用 选择培养分离 的方法，或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。 3、筛选菌株的培养基 KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。 4、选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 （二）、统计菌落数目： 1、活体计数法----稀释涂布平板法 （1）操作方法：稀释涂布平板 → 统计菌落数。 （2）原理：1个菌落→1个活菌。 （3）统计原则 ①、选 30～300 个菌落的平板统计。 ②、每个稀释度取3个平板取其平均值。 （4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ，因此统计结果一般用 表示。 每克样品中的菌株数= 。 C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积； M:稀释倍数。 2、显微镜直接计数 （三）设置对照 1、设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 2、对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验 组。 实验组： 对照组：设置对照 ---- 同等条件下，培养空白培养基。 四、实验设计 （一）土壤取样? 1、土壤是天然培养基 ---- 其微生物数量 、种类 。 2、土壤取样： （1）取样的位置：土壤中70～90％是细菌。在富含有机质的土壤层的3～8cm处中分布着绝大多数的细菌。 （2）取样要求：铲去表层土。 （1）、测细菌数：一般用104、105、106稀释液。 （二）样品稀释 （2）、测放线菌：一般用103、104、105稀释液。 原则：确保平板上的菌落数在 之间。 （3）、测真菌数：一般用102、103、104稀释液。 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2、培养：细 菌：30～37℃，1～2d； （三）微生物的培养与观察 放线菌: 25～28℃, 5～7d； 霉 菌: 25～28℃, 3～4d。 3、观察： a. 每24h统计一次菌落数目。 原因：不同种类的微生物，往往需不同的培养温度和培养时间，每隔24h统计1次菌落数目，选取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 b. 以“稳定菌落”为观察对象。原因：不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。 （四）鉴定 酚红鉴别培养基：鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→ 培养基碱性增强→ 酚红变红→ 结论：该细菌能分解尿素。 注意： 1、在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。 2、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 五、实验的具体操作 （一）、无菌操作 1、土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 2、制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 3、样品的稀释： （1）、应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。 （2）、在稀释土