毛细管电泳原理及分析策略.ppt

第六章检测器选择小分子检测大分子检测第64页,共80页，星期六，2024年，5月CE检测器种类及性能第65页,共80页，星期六，2024年，5月小分子检测有紫外吸收首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器无紫外吸收可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIF检测器需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测第66页,共80页，星期六，2024年，5月大分子检测蛋白、核酸可以首先选择紫外检测器如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用LIF检测如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再LIF检测需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测多糖含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIF、UV的方式检测第67页,共80页，星期六，2024年，5月第七章分离条件选择流程分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考：第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成及其性质；第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式，若无样品信息可先选CZE；第68页,共80页，星期六，2024年，5月条件选择流程第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接紫外吸收；第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心过滤除蛋白等；第五步，根据样品解离常数计算最佳pH，或利用75μmID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;第69页,共80页，星期六，2024年，5月条件选择流程第六步，根据所需pH构建缓冲体系，包括进一步优化pH、缓冲试剂浓度等；第七步，优化其他操作参数，如毛细管尺寸、分离电压和温度等；第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；第九步，确定是否需要换用其他分离模式。第70页,共80页，星期六，2024年，5月条件选择流程在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项：①最好对样品和缓冲液进行过滤或离心处理。②毛细管的洗涤或平衡，与缓冲体系、pH以及柱子有关。磷酸根与石英和玻璃之间存在慢相互作用，需要延长平衡或冲洗时间，处理的时间应由分离重现性决定。第71页,共80页，星期六，2024年，5月条件选择流程③欲降低缓冲液的电导，应尽量使用所谓的“生物缓冲试剂”；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。④欲保持分离重现，要尽量采用相同的条件，包括毛细管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。第72页,共80页，星期六，2024年，5月第八章各类物质的分离要点阴离子及有机酸此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法间接紫外法一般以铬酸钠等物质作为背景吸收物CTAB通常用作电渗流反向剂，以加速出峰，提高峰的尖锐度要使用反向极性分离第73页,共80页，星期六，2024年，5月各类物质的分离要点阳离子及金属离子的分离此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法间接紫外法一般以氨基吡啶等物质作为背景吸收物与阴离子不同的是阳离子的分析不需要在缓冲溶液中添加电渗流反向试剂也不需要使用反向极性分离第74页,共80页，星期六，2024年，5月各类物质的分离要点易电离有极性的化合物一般采用长60cm的毛细管分离的最佳pH在分析物pKa+/-1左右通常不需要添加剂第75页,共80页，星期六，2024年，5月各类物质的分离要点弱极性物质和水溶性差的物质（一些中药成分、农药等）要注意分析物的溶解性，防止在毛细管中的沉淀通过有机溶剂的添加，提高分析物在buffer中的溶解度添加SDS，增加溶解度降低样品中分析物的浓度，延长ramptime也可以防止分析物的析出第76页,共80页，星期六，2024年，5月各类物质的分离要点还原性的单糖、寡糖和多糖（葡萄糖、半乳糖等及其聚合物）通常无紫外和荧光，注意检测问题可用APTS等衍生试剂衍生，使其带上电荷和紫外/荧光基团多糖也可以采用末端吸收来检测（180-200nm），不需要衍生化处理，但是要尽量采用高pH使得羟基部分电离带电第77页,共80页，星期六，2024年，5月各类物质的分离要点非还原性的单糖、寡糖和多糖很难采用衍生的方法检测，通常对单糖和寡糖采用间接检测法