《分子生物学技术》学习要点.doc
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第二节分子生物学技术
【学习目标】
1.根据DNA复制的原理及过程，理解PCR技术的原理及过程。
2.掌握PCR技术的基本操作。
【学习重、难点】
重点
1.尝试PCR（DNA聚合酶链式反应）技术的基本操作。
2.理解PCR的原理，讨论PCR技术的应用。
难点
1.尝试PCR（DNA聚合酶链式反应）技术的基本操作。
2.体验PCR这一常规分子生物学实验方法。
【学习要点梳理】
一、PCR体外扩增DNA与生物体内DNA复制的比较
体内复制
PCR反应
不同点
解旋
在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开
加热至94℃左右，双链全部解开，不需解旋酶
引物
小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
不同点
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成
分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72℃左右
特点
边解旋边复制，半保留复制
体外迅速扩增
DNA
聚合酶
需要
需要TaqDNA
聚合酶
不同点
循环
次数
受生物体自身控制
30多次
温度
体内温和条件
高温（可变）
产物
完整DNA
DNA片段
相同点
①需提供DNA复制的模板
②以四种脱氧核苷酸为原料
③都需要一定的缓冲溶液
④子链延伸的方向都是从5′端到3′端
特别提醒①DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。
②解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都可催化形成磷酸二酯键。
③DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′羟基上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
④在PCR反应中，加入的四种脱氧核苷酸实际上是四种脱氧核苷三磷酸，既是原料，也是能源。
⑤在PCR反应中加入的Mg2＋实际上是Taq聚合酶的激活剂。
二、PCR技术相关知识分析
1.PCR原理：DNA热变性的原理
双链DNA单链DNA
2.PCR引物
（1）引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链作引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
（2）引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR反应失败。
（3）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。
3.PCR扩增的过程
（1）变性：当温度上升到94℃时，双链DNA解旋为单链，如下图：
（2）退火：温度下降至40～60℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
（3）延伸：当温度上升至72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
4.PCR扩增数目的理论计算
理论上DNA扩增呈指数增长，若只有一个DNA模板，则复制n次后有2n个DNA；若一开始有m个DNA模板，则复制n次后有m×2n个DNA。实际操作过程中，由于无关变量的影响，一般来说，实验值要略小于理论值。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段序列呈指数扩增。