槐角中总黄酮分离提取工艺山奈素纯化工艺及生物活性的研究.doc

槐角中总黄酮分离提取工艺、山奈素纯化工艺及生物活性的研究 Abst ract..3 前 1 综 言6 述8 1.1 山奈素简介.8 1.2 山奈素的主要植物来源8 1.3 槐角的主要活性成分及其药理作用..10 1.4 槐角活性成分在生活中的应用.12 2 研 究 思 路. 1 9 2.1 研究的目的和意义.19 2.2 研究内容..19 2.3 本课题设计思路..20 2.4 关键技术..20 3 实 验 部 分. 2 1 3.1 仪器、材料与试剂..21 3.2 HPLC 测定方法21 3.3 原料药物的确定21 3.4 槐角指纹图谱的建立..22 3.5 槐角在一个生长周期中黄酮含量的变化规律研究..23 3.5.1 提取原材料前处理. 23 3.5.2 实验方法24 3.6 槐角中总黄酮的提取分离工艺研究..24 3.6.1 提取液选择. 24 3.6.2 提取温度优化 24 3.6.3 提取料液量优化24 3.6.4 提取时间优化 24 3.7 槐角中分离提取山奈素的工艺路线.25 3.7.1 树脂选择25 贵州大学2009届硕士学位论文 3.7.2 洗脱浓度选择 26 3.8 槐角提取物中分离提纯山奈素的工艺路线..26 3.8.1 萃取剂的选择 26 3.8.2 纯化工艺研究 26 3.9 槐角提取物中山奈素生物活性研究..26 3.9.1 实验药材27 3.9.2 实验动物27 3.9.3 实验方法27 3.10 硅胶吸附色谱分离提纯山奈素的工艺研究27 4 结 果 与 讨 论29 结 致 论.45 谢.46 参 考 文 献..47 附 录.53 原 创 性 声 明. 54 贵州大学2009届硕士学位论文 摘 要 山奈素是一种生物黄酮类物质,是蜂胶、百蕊草片、银杏叶片等药物的主要 成分。研究表明,山奈素无毒无害,具有平喘、祛痰止咳、降低血压、增强毛细 血管抵抗力、降血脂、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量等作用。已广泛用于临床 治疗缺血性心脑血管病、内分泌疾病及各种慢性炎症。在肿瘤临床治疗的应用上, 山奈素能减轻常规化疗带来的毒副作用,与化疗药物联合应用可起到协同增效的 抗肿瘤作用等,尤其适用于年老体衰伴有各种并发症的晚期肿瘤患者,深入研究 可望成为有效的抗癌防癌的治疗及保健制剂。山奈素由于其在中药中含量较低, 分离提取较为困难。虽然有报道从高良姜药材中分离出山奈素,但事实上,并非 所有的高良姜药材中都含有山奈素成分。目前系统地从槐角中提取总黄酮以及从 其提取物中纯化山奈素的方法还比较少,本课题的目的就是为了找到一条合理 的、经济适用的水浸提方法将槐角中总黄酮提取出来并纯化山奈素。使其具有成 本低、工艺简单、综合利用率高等优点,并通过动物实验了解山奈素的生物活性。 研究内容如下: 1 确定槐角为山奈素提取原料 通过HPLC方法鉴定槐米、山奈、银杏叶、金钱草和槐角中山奈素含量,确 定槐角为提取分离山奈素的原料物。 2 成功地研究出槐角在一个生长周期中总黄酮含量的变化规律 四月份采摘的是槐花,含量最高为 3.22 %(其总黄酮中主要成分为槲皮素, 山奈素含量较少);五月份和六月份采摘的是刚结果的槐角,含量较四月份低, 七月份槐角较成熟,含量也随之上升;八月份槐角最饱满,含量较高为 2.31 % (其总槲皮素含量低,山奈素的含量高);九月份含量比八月份稍低,原因可能 是槐角开裂部分籽掉落而影响含量;十月份之后槐角基本掉落,无采摘意义。 3 HPLC 方法鉴定槐角中总黄酮组分 通过标准的槲皮素和山奈素样品,使用 HPLC 方法,建立槐角中总黄酮的组 成成分 HPLC 指纹图谱。 4 槐角中提取总黄酮 使用 HPLC 方法对槐角中的黄酮组分进行测定,在温度梯度、料液梯度、时 -1- 贵州大学2009届硕士学位论文 间梯度、浓度梯度等方面逐一筛选浸提条件,成功地找到槐角与料液(水)比例 为 1∶8,温度为 90 ℃ 下浸提 2 次,每次 2 h,浸提液用 AB-8 型大孔树脂对其 总黄酮进行吸附,用纯水洗去无机盐,再用 60 % 的乙醇洗脱,蒸干洗脱液后得 到槐角提取物总黄酮。成功地找到了槐角中黄酮组分提取分离的最佳条件。 5 槐角总黄酮中纯化山奈素 利用槐角提取物酸水解实验成功地从槐角提取物中分离出山奈素,购买的槐 角提取物中山奈素含量为 15.7 %,用水解液(HCl 4 mol/L:甲醇3:7)水解 3 h, 调水解液至弱碱性,回收甲醇至无醇,冷却后抽滤,再经过萃取后纯度提高,山 奈素单体含量提高到 90 % 以上,收率也在 90 % 以上。 6 槐角总黄酮中山奈素生物活性研究 通过动物实验,对槐角提取物中山奈素抗氧化的生物活性进行研究,结果表 明衰老时血清 TAA 及心肌组织 SOD 活性均降低,LPO 含量增高;给以槐