蛋白质样品的预处理-姜老师.pdf

蛋白质样品的预处理和双水相简介 蛋白质样品的预处理和双水相简介 姜韬 姜韬 7/19/2008 7/19/2008 样品获得和预处理的概念和意义 预处理 确定蛋白质样品的形态（format) 确定蛋白质样品的形态（format) 浓度 黏度 体积 浓度 黏度 体积 确定样品提取物中有害物 确定样品提取物中有害物 降解酶类 脂类(醚，Freon) 不溶物 降解酶类 脂类(醚，Freon) 不溶物 确定样品中的主要干扰物 确定样品中的主要干扰物 核酸 色素 强结合成分 核酸 色素 强结合成分 蛋白质样品的形式 蛋白质样品的形式 （format）要适合即将进行 （format）要适合即将进行 的纯化步骤 的纯化步骤 按基因工程的概念 细胞的破碎是基因 按基因工程的概念 细胞的破碎是基因 工程上下游的分界 工程上下游的分界 技术经济要求：基因工程是个统一的 技术经济要求：基因工程是个统一的 整体其成本和生产能力要统筹规划 整体其成本和生产能力要统筹规划 细胞的破碎方式直接关系到下游的纯 细胞的破碎方式直接关系到下游的纯 化成本和环保 : 目标分子回收 分离负 化成本和环保 : 目标分子回收 分离负 荷和排放 分泌型表达 荷和排放 分泌型表达 目标产物的形式: 可溶和正确折叠 目标产物的形式: 可溶和正确折叠 表达时注意的问题: 表达系统和诱 表达时注意的问题: 表达系统和诱 导方式 - 严格限制性表达系统:外 导方式 - 严格限制性表达系统:外 源基因表达产物的出现被严格的控 源基因表达产物的出现被严格的控 制 防止对宿主细胞的伤害和诱导性 制 防止对宿主细胞的伤害和诱导性 降解和修饰; 降解和修饰; 诱导方式的选择 不要形成错误折叠 诱导方式的选择 不要形成错误折叠 产物. 产物. 慎重选择温度诱导方式 慎重选择温度诱导方式 真核基因表达产物的几个问题: 真核基因表达产物的几个问题 翻译后修饰问题 酵母和哺乳动物细 翻译后修饰问题 酵母和哺乳动物细 胞表达后糖基化差别很大 胞表达后糖基化差别很大 糖基化异构体的总活性回收 糖基化异构体的总活性回收 最好的目标产物获得方式是 最好的目标产物获得方式是 温和的选择性抽提 温和的选择性抽提 了解生物体表面的结构性质和通透 了解生物体表面的结构性质和通透 性调节方法 性调节方法 抽提液的组成： 缓冲组分 合适的 抽提液的组成： 缓冲组分 合适的 pH 要结合酸碱溶液的滴定调节 尽 pH 要结合酸碱溶液的滴定调节 尽 量低的离子强度 稳定成分 : 钙镁离 量低的离子强度 稳定成分 : 钙镁离 子 游离巯基 重金属离子鳌合 辅酶 子 游离巯基 重金属离子鳌合 辅酶 辅基 辅基 温和抽提实例 温和抽提实例 1. 大肠杆菌的渗透冲击抽提法可以获得胞内 1. 大肠杆菌的渗透冲击抽提法可以获得胞内 表达的