高效液相色谱仪的使用.ppt

3.色谱柱担负分离作用，是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子。一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。第32页,共56页，2024年2月25日，星期天色谱柱由柱管、柱接头、筛板（滤片）、堵头和螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。常规分析的色谱柱有内径2~5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长10~30cm。第33页,共56页，2024年2月25日，星期天色谱柱使用注意事项柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；第34页,共56页，2024年2月25日，星期天进样样品要提纯，避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理；在色谱柱前加预柱或保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱，可以起到保护、延长柱寿命的作用，可更换。每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用清洗柱；第35页,共56页，2024年2月25日，星期天若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂如甲醇保存，拧紧柱接头，防止溶剂挥发干燥。新柱不用是可放时间长些。柱压升高的原因有样品和流动相有杂质或颗粒、缓冲液盐结晶使柱子堵塞、体系不平衡等。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。第36页,共56页，2024年2月25日，星期天溶剂和样品过滤对色谱柱、仪器起到保护作用。对色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。对仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。第37页,共56页，2024年2月25日，星期天4.检测器检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。检测器的类型有紫外可见光、荧光、电化学、电导、放射性检测器等。第38页,共56页，2024年2月25日，星期天性能指标

（1）噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。（2）灵敏度：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。（3）检测限（LOD）：试样中被测物能被检测到的最低量，以信噪比接近为3:1时的相应浓度作为检测限。以信噪比接近为10:1时的相应浓度作为定量限（LOQ）第39页,共56页，2024年2月25日，星期天（4）线性范围：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围。检测器所产生的信号与被测样品的量呈一定的函数关系作为依据。线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些。第40页,共56页，2024年2月25日，星期天5.色谱工作站色谱工作站主要有电脑、信号记录系统和分析软件。不同的色谱工作站在处理数据时情况不同，但目前大多是记录仪记录检测信号，使用积分仪计算峰高、峰面积和保留时间等参数。好的工作站除能采集、处理和分析数据外，还能控制仪器操作，对色谱系统进行优化。第41页,共56页，2024年2月25日，星期天6.柱温箱色谱柱和检测器都要求能准确地控制工作环境温度，恒温精度要求在±0.1~0.5℃之间。温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。一般来说，温度升高，可提高溶质在流动相中的溶解度，从而降低其分配系数，但对分离选择性影响不大；还可使流动相的粘度降低，从而改善传质过程并降低柱压。但温度太高易使流动相产生气泡。温度对保留时间有影响。要根据色谱柱说明书上要求的最适宜温度设置柱温箱的温度。第42页,共56页，2024年2月25日，星期天7.超声脱气流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起猝灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。一般流动相溶液需超声20~30min。这种离线脱气不能维持溶剂的脱气状态，在停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中，在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。在线（系统内）脱气法无此缺点。第43页,共56页，2024年2月25日，星期天8.灯的保养荧光分析用的是氙灯，5000元左右