高效液相色谱仪的使用.ppt

六通阀进样演示第31页，共56页，星期日，2025年，2月5日3.色谱柱担负分离作用，是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子。一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。第32页，共56页，星期日，2025年，2月5日色谱柱由柱管、柱接头、筛板（滤片）、堵头和螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。常规分析的色谱柱有内径2~5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长10~30cm。第33页，共56页，星期日，2025年，2月5日色谱柱使用注意事项柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；第34页，共56页，星期日，2025年，2月5日进样样品要提纯，避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理；在色谱柱前加预柱或保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱，可以起到保护、延长柱寿命的作用，可更换。每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用清洗柱；第35页，共56页，星期日，2025年，2月5日若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂如甲醇保存，拧紧柱接头，防止溶剂挥发干燥。新柱不用是可放时间长些。柱压升高的原因有样品和流动相有杂质或颗粒、缓冲液盐结晶使柱子堵塞、体系不平衡等。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。第36页，共56页，星期日，2025年，2月5日溶剂和样品过滤对色谱柱、仪器起到保护作用。对色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。对仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。第37页，共56页，星期日，2025年，2月5日4.检测器检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。检测器的类型有紫外可见光、荧光、电化学、电导、放射性检测器等。第38页，共56页，星期日，2025年，2月5日性能指标

（1）噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。（2）灵敏度：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。（3）检测限（LOD）：试样中被测物能被检测到的最低量，以信噪比接近为3:1时的相应浓度作为检测限。以信噪比接近为10:1时的相应浓度作为定量限（LOQ）第39页，共56页，星期日，2025年，2月5日（4）线性范围：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围。检测器所产生的信号与被测样品的量呈一定的函数关系作为依据。线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些。第40页，共56页，星期日，2025年，2月5日关于高效液相色谱仪的使用第1页，共56页，星期日，2025年，2月5日一、概述色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年提出。分离出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素。因一战爆发并未重视。第2页，共56页，星期日，2025年，2月5日色谱柱固定相流动相色谱法第3页，共56页，星期日，2025年，2月5日色谱的发展20世纪70年代高效液相色谱出现1906色谱法发明20世纪50年代气相色谱出现并广泛使用19世纪中叶人们开始注意一些简单的扩散现象染料目前HPLC已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段第4页，共56页，星期日，2025年，2月5日色谱的类型气相色谱：流动相是气相液相色谱：流动相是液相色谱液相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱HPLC气相色谱第5页，共56页，星期日，2025年，2月5日1.HPLC与经典LCHPLC比起经典LC的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。经典色谱是重力加料，流出速度极慢，流动相速度为30ml·h-1，需用20h才能分离出20种氨基酸；而HPLC配备了高压输液设备，流速最高可达10ml·min-1，只需lh之内即可完成氨基酸的分离。第6页，共56页，星期日，2025年，2月5日高效：固定相具有分离效果好、效率高，如用C18柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。高灵敏