高效液相色谱仪的使用.ppt
六通阀进样演示第31页,共56页,星期日,2025年,2月5日3.色谱柱担负分离作用,是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好,分析速度快等。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效;对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子。一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。第32页,共56页,星期日,2025年,2月5日色谱柱由柱管、柱接头、筛板(滤片)、堵头和螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成,色谱柱两端的柱接头内装有筛板,是烧结不锈钢或钛合金,取决于填料粒度,目的是防止填料漏出。常规分析的色谱柱有内径2~5mm(常用4.6mm,国内有4mm和5mm),柱长10~30cm。第33页,共56页,星期日,2025年,2月5日色谱柱使用注意事项柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;选择使用适宜的流动相(尤其是pH),以避免固定相被破坏;要注意流动相的脱气;避免使用高粘度的溶剂作为流动相;第34页,共56页,星期日,2025年,2月5日进样样品要提纯,避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内,需要对样品进行预处理;在色谱柱前加预柱或保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱,可以起到保护、延长柱寿命的作用,可更换。每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品;每天分析测定结束后,都要用清洗柱;第35页,共56页,星期日,2025年,2月5日若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂如甲醇保存,拧紧柱接头,防止溶剂挥发干燥。新柱不用是可放时间长些。柱压升高的原因有样品和流动相有杂质或颗粒、缓冲液盐结晶使柱子堵塞、体系不平衡等。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。第36页,共56页,星期日,2025年,2月5日溶剂和样品过滤对色谱柱、仪器起到保护作用。对色谱柱:由于填料颗粒很细,色谱柱内腔很小,溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。对仪器:溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损,同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。第37页,共56页,星期日,2025年,2月5日4.检测器检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低(即对温度、流量等外界变化不敏感)、线性范围宽、重复性好和适用范围广。检测器的类型有紫外可见光、荧光、电化学、电导、放射性检测器等。第38页,共56页,星期日,2025年,2月5日性能指标
(1)噪音和漂移都会影响测定的准确度,应尽量减小。(2)灵敏度:表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。(3)检测限(LOD):试样中被测物能被检测到的最低量,以信噪比接近为3:1时的相应浓度作为检测限。以信噪比接近为10:1时的相应浓度作为定量限(LOQ)第39页,共56页,星期日,2025年,2月5日(4)线性范围:指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围。检测器所产生的信号与被测样品的量呈一定的函数关系作为依据。线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些。第40页,共56页,星期日,2025年,2月5日关于高效液相色谱仪的使用第1页,共56页,星期日,2025年,2月5日一、概述色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年提出。分离出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素。因一战爆发并未重视。第2页,共56页,星期日,2025年,2月5日色谱柱固定相流动相色谱法第3页,共56页,星期日,2025年,2月5日色谱的发展20世纪70年代高效液相色谱出现1906色谱法发明20世纪50年代气相色谱出现并广泛使用19世纪中叶人们开始注意一些简单的扩散现象染料目前HPLC已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段第4页,共56页,星期日,2025年,2月5日色谱的类型气相色谱:流动相是气相液相色谱:流动相是液相色谱液相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱HPLC气相色谱第5页,共56页,星期日,2025年,2月5日1.HPLC与经典LCHPLC比起经典LC的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。经典色谱是重力加料,流出速度极慢,流动相速度为30ml·h-1,需用20h才能分离出20种氨基酸;而HPLC配备了高压输液设备,流速最高可达10ml·min-1,只需lh之内即可完成氨基酸的分离。第6页,共56页,星期日,2025年,2月5日高效:固定相具有分离效果好、效率高,如用C18柱,采用梯度洗脱,可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。高灵敏