大鼠ABHD8和MKNK2基因真核表达载体构建.docx

本科毕业论文大鼠ABHD8和MKNK2基因真核表达载体构建 大鼠ABHD8和MKNK2基因真核表达载体构建摘要：动物体内存在很多功能未知或未被完全揭示的基因，这些基因可能在动物体内发挥重要作用。MKNK2和ABHD8基因是本实验室在研究大鼠垂体中与生长相关miRNAs功能时所发现的miR-7a-5p的两个潜在靶基因，但这两个基因在动物生长方面的作用并不清楚。为了后续能更好地研究MKNK2和ABHD8基因在大鼠垂体中的功能，本试验根据NCBI数据库报道的大鼠MKNK2以及ABHD8基因参考序列，以大鼠垂体组织的cDNA为模板，采用常规克隆技术获得大鼠MKNK2和ABHD8基因的CDs片段，将其克隆到pMD-19T载体，经测序正确后，利用in-fusion技术将目的基因构建到pcDNA3.1（+）载体，经双酶切及测序鉴定无误，表明成功构建了MKNK2和ABHD8基因的真核过表达载体，为这两个基因功能的后续研究提供基础。关键字：大鼠 ABHD8 MKNK2 表达载体构建Abstract:The?presence?of?animals?or?a?lot?of?unknown?function?has?not?been?fully?disclosed?genes?that?may?play?an?important?role?in?animals.?MKNK2?and?ABHD8?genes?are?two?potential?target?genes?of?miR-7a-5p?in?this?laboratory?study?in?rat?pituitary?growth?associated?miRNAs?function?when?found,?but?the?role?of?the?two?genes?in?terms?of?the?growth?of?the?animals?is?not?clear.?In?order?to?better?follow-up?study-and?ABHD8?gene?function?in?rat?pituitary,?the?test?according?to?MKNK2?and?ABHD8?gene?reference?sequence?NCBI?database?reported?rat?to?rat?pituitary?tissue?cDNA?as?a?template,?using?conventional?cloning?techniques?rats?MKNK2?and?CDs?ABHD8?gene?fragment?was?cloned?into?pMD-19T?vector ?sequenced?properly,?the?use?of?in-fusion?technology?will?be?built?into?the?gene?of?pcDNA3.1?(+)?vector?by?double?digestion?and?sequencing?correct?,?indicating?a?successful?eukaryotic?expression?vector?MKNK2?over?and?ABHD8?genes?provide?the?basis?for?the?two?follow-up?studies?of?gene?function. Keywords: rat ABHD8 MKNK2 expression vector construction 目 录前言...........1.1 ABHD8简介1.2 MKNK2简介1.3基因克隆技术的历史及发展1.4 载体构建1.5 载体构建的原理材料与方法2.1材料2.1.1主要仪器设备2.1.2试剂与耗材2.1.3 主要试剂配制2.1.4 质粒及菌株2.2 方法2.2.1 基因扩增引物设计2.2.2大鼠MKNK2以及ABHD8基因的CDs片段扩增2.2.3 目的片段的PCR产物回收2.2.4 目的基因与pMD-19T载体的连接反应2.2.5连接产物的转化2.2.6 转化子的PCR鉴定及测序2.2.7 大鼠MKNK2和ABHD8基因真核过表达载体构建2.2.7.1 大鼠MKNK2和ABHD8基因克隆载体的质粒提取2.2.7.2 MKNK2和ABHD8基因扩增2.2.7.3 扩增产物纯化回收2.2.7.4 pcDNA3.1（+）重组质粒的构建2.2.7.5 重组质粒抽提及鉴定结果与分析3.1 ABHD8和MKNK2基因克隆载体构建3.2 ABHD8和MKNK基因CDs区扩增 3.3目的基因克隆到真核表达载体 3.4 含有目的基因的真核表达载体鉴定 4 讨论 4.1 In-Fusion技术与传统克