脓汁和粪便标本中病原菌的检测.pdf

脓汁和粪便标本中病原菌的检测 一、实验目的 1、 了解细菌生长的基本营养条件 2、 掌握培养基制备的原则和一般程序 3、 了解培养基的种类（按不同的分类方法） 4、 掌握常用的消毒灭菌法及其机理 5、 掌握检查培养基是否合格的方法 6、 了解细菌生长繁殖的方式和速度 7、 掌握无菌操作技术 8、 掌握细菌的分离与培养方法 （熟练平板划线分离法） 9、 了解并比较细菌在固体培养基的菌落特征 10、 掌握细菌的纯培养方法 11、 了解各种细菌染色法及其原理 12、 掌握革兰氏染色法及了解其原理 13、 掌握细菌涂片标本的制备 14、 掌握显微镜油镜的使用 15、 了解细菌的基本形态 16、 掌握液体培养基的接种 17、 掌握细菌的糖发酵实验、抗生素敏感性实验、血浆凝固酶实验的原理、方法、结果 分析及应用 18、 掌握纸片扩散法 19、 掌握半固体穿刺接种法 20、 掌握玻片凝集试验 21、 掌握玻璃器材的洗刷 二、实验器材 1、培养基的制备 天平、称量皿、药勺、锥形瓶、量筒、试管、试管架、刻度吸管、洗耳 球、棉塞 、牛皮纸、橡皮筋、干粉培养基、酒精灯、火机 2、细菌的分离培养 脓汁标本1 支、粪便标本1 支、碘酒棉球1 瓶、眼科镊子2 把、伊红 美兰平板2 个、营养琼脂平板2 个、普通营养琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、接种环 3、细菌的纯培养 斜面4 支、细菌分离培养物 4、细菌的形态学检查 斜面培养物4 支、营养肉汤4 支、生理盐水2 支、镜油瓶、拭镜纸 1 套、吸水纸1 本、载玻片4 张、结晶紫染液、芦戈氏碘液、95%酒精、稀释石炭酸复 红、染色架 5、细菌的生化试验 斜面培养物4 支、营养肉汤培养物（菌液）4 支、半固体琼脂4 支、 营养琼脂平板4 个、糖发酵管1 套、抗菌素（青霉素、链霉素、庆大霉素）纸片1 套、 眼科镊子2 把、接种针、小砂轮、葡萄糖发酵微量管、乳糖发酵微量管、兔血浆、生理 盐水、载玻片 6、细菌的血清学试验、结果分析 半固体培养物4 支、药敏试验培养物4 个、微量发酵管 培养物1 套、尺子 三、方法与步骤 1.培养基的制备 干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸、牛皮纸， 用橡皮筋扎好 →放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到高压蒸汽灭菌室（洗刷室）→灭菌 →不同类型培养基 2.细菌的分离培养——平板划线分离法 ①接种环烧灼灭菌，以免污染标本 ②取标本3～5ul ③晃动平板，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线 痕迹，以便控制划线 ④接种环与平板呈30～40 度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线， 边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30 条 ⑤烧掉接种环上多余的标本 ⑥转动平板，通过第一区5～7 次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划第二区。⑦ 转动平板，接种环通过第二区1 次，划第三区 ⑧转动平板，接种环通过第三区 1 次，划第四区 ⑨划第五区 ⑩每区划线不少于30 条，整个平板划线不少于150 条线。上下两条线重叠不影响分离结果 11 ○37℃培养24 小时 分工：a)甲→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色） b)乙→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色） c)丙→粪便标本→伊红美蓝平板(紫色） d)丁→粪便标本→伊红美蓝平板(紫色） 3.细菌的纯培养 斜面接种分工： 甲→普通平板→黄色菌落→1 支斜面 乙→普通平板→白色菌落→1 支斜面 丙→ EMB 平板→紫黑菌落→1 支斜面 丁→ EMB 平板→粉红菌落→1 支斜面 注意：1、斜面正面上2/3 作标记：组号、黄色、白色、紫黑、粉红。 2、选择平板上相同的菌落数多的、典型的、容易挑取的单菌落。 3、在平皿底部玻璃上，画个大圈选取菌落，得到同组同学认可，才能挑取。 斜面接种法： ①接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉一条细菌接种线。 ②再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线。 ③细菌涂布接种在斜面培养基的表面。 灭菌：收集平板 → 灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置） → 速送灭菌室 → 高压蒸 汽灭菌 → 洗刷。 4.细菌的形态学检查 从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄 色或白色。 从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经