DNPH比色法一种简单的蛋白质羰基含量测定方法.docx

320 毒理学杂志2005年12月第19卷第4期J Toxic胡December 2035 Vol 19 No，4中围分类号：R113 文献标识码：B 文章编号：1002—3127(2005)04—0320—03 -技术与方法· DNPH比色法：一种简单的蛋白质羰基含量测定方法 段丽菊，刘英帅，朱燕，扬旭(华中师范大学生命科学学院环境科学实验室，湖北武汉430079)美奠词：蛋白质氧化损伤社，4．二硝基苯肼法；羰基含量测定自由基对机体的氧化损伤大致分为5个方面：(1) 不同年龄小鼠肝脏内质网相关伴侣蛋白的羰基含量进 对抗氧化系统的损伤；(2)对DNA的氧化损伤。(3)对行了测定，结果显示这些关键的蛋白随着年龄的增长， 脂质的氧化损伤，近几年发现的8一异前列腺素砣a(8． 羰基化现象越严重，这影响了蛋白的折叠和其他的一 iso．PGF2 a)是自由基损伤细胞膜脂质更好的指标；(4) 些功能。羰基化的蛋白被认为是氧化损伤的指示物， 对蛋白质的氧化损伤；(5)对糖类的氧化损伤，反映自 它随着年龄的增长而增加，被氧化蛋白的功能显著削 由基对糖影响的标志物目前还不多，常用的指标有透 弱。羰基化蛋白不可以修复，它们被降解或以损伤蛋 明质酸“。。蛋白质不仅是生物体的重要组成成分，而 白或未折叠蛋白的形式存在，其含量在一些年老或与 且在生命活动中担负重要的功能，在生物体中有催化、 年老相关疾病的动物组织中含量升高”“。 调节、转运、贮存、运动和支架作用等功能。对蛋白质蛋白质羰基在体内的形成主要是通过金属离子催 氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。蛋白质的 化氧化系统(MCO系统)完成的““。在这个过程中， 羰基化被广泛地用于评价各种生物有机体的氧化程 Fe2+和cu2+可以结合在蛋白质的阳离子结合位点。度”J，蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的敏感指 被H20。或听攻击之后将侧链含有氨基的氨基酸羰标”。。2，4-二硝基苯肼(DMH)比色法是测定蛋白质 基化”1。此外，羟自由基也可直接作用于肽链，使肽链 糍基含量的经典方法。目前这种方法在国内罕有报道 断裂，引起蛋白质一级结构的破坏，在断裂处产生羰 和介绍，现就DNPH比色法的原理、具体实现方法、应 基。羰基化蛋白极易相互交联、聚集为大分子从而降 用、特点以及本实验室在从事相关实验研究中获得的 低或失去原有蛋白质的功能，后者又可加重细胞内蛋 经验和一些值得注意的问题予以介绍。 白水解酶的负担，最终导致疾病。1987年Oliver等经研究提出可以用蛋白质羰基含1蛋白质氧化损伤和羰基的生成量作为判定蛋白质氧化损伤的一项指标。常用的检测 对蛋白质的氧化损伤可以导致一系列的共价修蛋白质羰基含量的方法主要有：硼氢化钠法”“、荧光 饰，包括脂质过氧化加合物的生成、二硫键的桥连、酪素肼法、荧光胺法、免疫杂交法”71和酶联免疫法““等。 氨酸侧链的硝基化和氨基酸的羰基化“1。研究已证实2，4．二硝基苯肼(DNFH)比色法是测定蛋白质羰基含衰老。16』、动脉粥样硬化1“、糖尿病“1、银屑癣”‘和脑溢量的经典方法。血u“等许多疾病与蛋白质的氧化损伤有关。当机体 过度运动““，或者长期暴露于CCI。“ 、乙醇““和金 2DNPH法的工作原理 属u4，等有害物质时，也会引起蛋白质的氧化损伤。自 被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2，4一 由基对DNA、蛋白质的损伤比对脂质的损伤更为重二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，2，4．二硝基苯 要。蛋白质被自由基损伤后，导致了氨基酸的羰基化 腙为红棕色的沉淀，将沉淀用盐酸胍溶解后即可在分 和酶活力的丧失”1。 光光度计上读取370 nm下的吸光度值，从而测定蛋白随着年龄的增长，羰基逐渐积累造成对生物大分质的羰基含量” 。 子的氧化损伤，从而使组织的功能下降。Rabek等对3操作步骤基金项目：国家“十五”科技攻关课题(2001BATt4801)3．1试样前处理 当测定组织中的蛋白质羰基含量作者筒介：段丽菊(1981一)，女．硕士，研究方向：生化与分子毒理。时，需要将蛋白质从组织当中提取出来，这时就要考虑通讯作者：杨旭．教授．博士生导师，研究方向：生化与分子毒理。组织中其他同样含有羰基的生物分子的干扰。因此， 万方数据毒理学杂志2005年12月第19卷第4期J Toxieol December 2005 Vol 19 No．4321在蛋白质抽提的过程当中，要去除这些干扰物质，以下5方法的优点以及一些值得注意的问题 是组织蛋白的抽提方法：(1)取一定量的组织，在冰的5．1优点用DNPH比色法优点是：操作简便，对设 生理盐水中漂洗，以去掉表面的血迹。(2)=[J11人一定量 备要求低(只需离心机和紫外可见光分光光度计)，便 的冰的HEPES缓冲液，做成质量分数为1