比色法测定食品蛋白质.ppt

Ⅲ.比色法测定食品蛋白质含量 一、方法的特点 与凯氏定氮法相比，用比色法测定生物材料中的蛋白质的含量，具有测定周期短、方便快捷的特点。此类方法是目前蛋白质含量测定的发展的必然趋势，但其测定结果的准确性和重现性比凯氏法要差些。 此外，本方法因对蛋白质在溶解性的要求而使其不具有通用性（“见方法的基本要求”）。 二、测定的依据和方法的种类 （一）方法的基本原理和依据 从生物遗传学角度看，同源蛋白质具有相同比例（或份额）的特征性基团，它们包括构成肽链的酰氨键、非α-氨基（碱性基团）、非末端竣基（酸性基团）和芳香族氨基酸等。随着蛋白质的含量的增加，其特征性基团的表现能力也随之呈现正相关的变化。因此，可以用通过凯氏定氮法已测定蛋白质含量的食品为标准样（称之与待测样具有同源蛋白质的标样），在其适合的条件下测定吸光度并制备标准吸收曲线。在相同条件下测同源的待测样品的光密度，然后从标准吸收曲线上查蛋白质的含量。 （二）方法的种类 比色法包括： 双缩脲法 紫外分光光度法 色素结合法 （三）比色法的基本要求 由于是用比色法测定蛋白质的含量，而比色法的测定液必须是真溶液，故要求采用此类方法的样品，其蛋白质是可溶的（对测试时使用的溶剂而言）。 在一般情况下，蛋白质的溶解是速度是比较低的，所以在进行样品预处理时应做剧烈振荡，从而使蛋白质充分地溶液于溶剂中。 要求用与待测样品具有同源蛋白质的标准制作标准曲线！！ 三、各论 （一）双缩脲比色法 双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故能呈此反应。可以把此反应看作是蛋白质所特有反应。 本方法是测定蛋白质浓度常用的方法之一，操作简便迅速。但此法灵敏度较差。 本方法可用于牛乳、豆类、油料、谷类种子制品（如小麦粉）蛋白质的含量测定。对于其它种类食品，应用范围较小。 三、各论 （二）色素结合法 在蛋白质的侧链中，有许多酸性基团或碱性基团，它们可以使蛋白质的溶液呈现碱性或酸性；而且，它们还有吸附碱性色素或酸性色素能力，并与对应的色素生成“蛋白质－色素”的沉淀。据此，可用色素结合法对蛋白质用比色法作定量分析。 此法是近年来发展比较快的蛋白质定量分析方法，在日本用于色素结合法的染料（色素）已用50余种。 有的色素与蛋白质生成可溶性有色“色素－蛋白质结合物，如考马斯亮蓝G-250色素结合法。 三、紫外分光光度法［牛乳实例］ 1．试剂 95～97%醋酸溶液。 2．样品测定操作 准确吸取牛乳0.3ml置于25ml比色管中，以95～97%醋酸溶液定容。摇动1分钟，于280纳米处测定其光密度。 3．标准曲线的制备 准确吸取（已用凯氏定氮法测得蛋白质含量的）标准牛乳0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml分别置于25ml比色管中，以97%醋酸溶液定容，其余同样品测定操作。 以标准样的加入量为横坐标、对应的光密度为纵坐标绘制曲线。 四、关于同源样品 某种牛奶 其单位重量的蛋白质有芳香族氨基酸10个，含有1%蛋白质的奶液对其特征性的紫外光的吸收强度为0.2。那么，含有X%蛋白质的奶液对特征性的UV的吸收强度为： AX牛 = K牛C牛= 0.2X 某种羊奶 其单位重量的蛋白质有芳香族氨基酸20个，含有1%蛋白质的奶液对其特征性的紫外光的吸收强度为0.4。那么，含有X%蛋白质的奶液对特征性的UV的吸收强度为： AX羊 = K羊C牛= 0.4X 结论： 不同源（物种）蛋白质的特征性基团的相对量是不同的，校准样不能通用。 END Esc