酶联免疫吸附试验——ELISA要点.ppt

酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) ——检测乙肝表面抗原 实验目的要求 掌握ELISA的基本原理 掌握ELISA双抗体夹心法检测HBsAg的原理、操作方法及结果判断 熟悉表面抗原检测的临床意义 （一）ELISA的原理 ELISA的基本原理 三种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂” （immunosorbent） ②酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate） ③酶作用的底物 在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。 再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 （二）方法类型及反应原理 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法 1 双抗体夹心法 ——是检测抗原最常用的方法 操作步骤 1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去其他未结合物质。 3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。 应用 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等 不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。 2 间接法 ——是检测抗体常用的方法 基本步骤 1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。 3）加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。 4）加底物显色。 应用 检测Ab的最常用的方法 只要更换不同的固相Ag，可以用一种酶标二抗检测各种与Ag相应的Ab。 3 竞争法 其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。 方法相同 ELISA的基本步骤 包被—洗涤—封闭—洗涤—加样—加酶结合物—加底物、显色剂—终止液—酶标仪检测 包被 将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。 抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。 固相载体 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。 可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。 ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。 固相载体 微颗粒 带有蛋白质结合功能基团，结合容量大、反应速度快 膜载体 硝酸纤维素膜（NC）、玻璃纤维素膜、尼龙膜，非共价键结合，但吸附能力强斑点ELISA 洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。 　封闭 ● 包被好的固相载体表面常留有少量未吸附位点，可非特异地吸附测定时加入的标本和酶标记物中的蛋白质，导致本底偏高。因此需用1％～5％牛血清白蛋白或5％～20％小牛血清等包被一次，消除上述干扰，此过程称为封闭。 ● 一般说来，双抗体夹心法，