酶联免疫吸附试验.doc

实验二 酶联免疫吸附试验 1.实验目的 ①了解ELISA反应原理、类型及特点 ②掌握直接ELISA操作步骤 ③通过实验认识抗体的双重性 2.实验原理 ① 抗原或抗体能物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附后的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。 ②酶可与抗体通过共价键连接而形成酶标记抗体，这种结合作用并不影响抗体的免疫学活性和酶的催化活性。 ③酶标抗体中的酶可催化无色底物形成有色产物，酶标抗体与相应抗原或抗体结合后，可根据有无颜色反应来判定是否有免疫反应发生，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比，因此，可以按底物显色的程度来显示试验结果。 3.实验器材及试剂 3.1器材 微量移液器，酶标仪、洗板机、96孔酶标板、PHSJ-4A型pH计等 3.2试剂 显色剂（TMB）、兔抗鸡IgG-HRP、牛血清白蛋白（BSA）、 Tween-20、标准品鸡IgG 3.3 各种缓冲液 （1）包被液（0.05 M碳酸盐缓冲液， pH 9.6） 0.lM Na2C03 1.59 g, 0.1M NaHCO3 2.93 g, 加DDH20（DDW） 至1 L，用精密pH计调整pH值到9．6； （2）封闭液 3％BSA，3g BSA溶于100 mL PBS中,调整PH 7.4； （3）洗涤及稀释液PBST和PBS(PH 7.4) 0.01mol/L PBS缓冲液 NaCl 8.014 g， KCL 0.201 g，Na2HPO4?12H2O 3.581 g KH2PO4 0.272g 溶于1000mL蒸馏水，调整pH至7.2，高温高压灭菌。1L PBS（pH 7.2）中加入0.5mL Tween-20配制成PBST。 （4）封闭液 称取0.1 g BSA溶于100 mL PBST中； （5）底物Buffer 称取7.16 gNa2HPO4·12H2O溶于100 mL去离子水中，量取25.7 mL于100 mL容量瓶中；再称取2.1 gC6H8O7?H2O溶于100 mL去离子水中，量取24.3 mL于容量瓶中；再加约50 mL去离子水定容，并调pH值至5.0。 （6）TMB工作液 底物A：TMB 40mg，无水乙醇或DMSO 10 mL； 底物B： 250 μL的A溶液，加10 mL底物Buffer，临用加20 μL H2O2； 最好现用现配。 Substrate A,B液必须4℃，避光保存。 （7）终止液 2M H2SO4：浓H2SO4 20 ml，加水至180 mL； （8）酶标抗体 兔抗鸡IgG-HRP，用PBST稀释；4℃保存30 d； 4. 操作步骤 ① 抗原包被 在酶标板上包被稀释好的标准鸡IgG，每孔加100 μL，4 ℃，静置包被过夜（17 h）； ×1600(即浓度为6.25μg/mL) ×3200（3.125μg/mL） ×6400（1.562μg/mL） ② 洗涤 PBST洗板3次，每孔加250 μL，每次3 min；最后一次丢弃孔中溶液后在滤纸上轻轻拍打，除去孔中残留溶液； ③ 封闭 加3% BSA，每孔250 μL，37℃温育2 h； ④ 洗涤 PBST洗板3次，每孔250 μL，每次3 min，同上； ⑤ 加酶标抗体 用PBST稀释酶标抗体至最适稀释度（×500），每孔加入100μL，37℃温育1h； ⑥ 洗涤 PBST洗板3次，250μL每孔，每次3min； ⑦ 显色 每孔100μL，37℃放置30 min； ⑧ 终止反应 于各反应孔中加入2M硫酸50μL ⑨ 结果判定 可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。 也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 5. 思考题 ① 封闭这一步操作为什么是必需的？ ② 为什么说抗体具有双重性？