重组腺病毒H101对肝癌细胞生长抑制的实验分析.pdf

————————————————————!壁三奎兰塑主兰焦堡奎 重组腺病毒H101对肝癌细胞生长 抑制的实验研究 专 业 外科学(普通外科) 博士生 陈灵华(2000秋博) 导 师 彭淑牖 教授 中文摘要 原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之～，死亡率居恶性肿瘤第 ．_位。尽管近年来肝癌的外科治疗获得了令人注目的成就，但对晚期 肝癌及术后广泛复发和转移的患者仍无满意的手术方式。肝癌的非手 术治疗主要有化疗、放疗、免疫治疗、中医治疗、躬频和微波消触 苜．H1){『这些治疗的效果还不甚理想。因此要进一步提高肝癌的治疗 效果，需要引入一种崭新机制的治疗手段。近年来随着肿瘤学、分子 乍物学和病毒学的发展，基因治疗正逐步进入临床，以其独特的治疗 机制为肝癌治疗提供一种新的选择。 腺病毒能够感染分裂和非分裂期的细胞。腺病毒El基因复合体的 表达列它的感染起重要作用。E1基因复合体包括E1A和E1B基因。 E1A!^合和抑制pRB，为病毒增殖创造良好的细胞内环境。病毒的复 制能激发p53通路诱导细胞凋亡或细胞周期停滞，从而中断病毒的感 染：I丽ElB一55kD能结合和抑制p53蛋白，保证病毒顺利复制并裂解细 胞。肿瘤细胞的pRB和p53基因经常发生突变或缺失；因此EIA或 E1B基因缺陷的腺病毒仍可分别在这些肿瘤细胞中选择性复制，但在 pRB和p53途径完好的正常细胞中的复制减弱。 H101是上海三维生物有限公司构建并获得国家专利的重组腺病 l ——一塑婆查兰堡主兰堡堡兰 突变的癌细胞中仍可表现出很强的细胞毒性作用，而在正常细胞中它 的复制被大大抑制。H101肿瘤增殖的选择性使它有望成为一种新的肿 瘤治疗药物。目前H101已经进入I临床试验阶段，但主要集中在体表肿 增的治疗，而对于深部肿瘤如肝癌、胃癌、结肠癌和食道癌的治疗尚 属空白。文献报道肝癌p53基因的突变率达30—50％。p53基因的突变 与肝癌分化、侵袭性、门静脉癌栓、转移能力与预后有密切相关性， 因此针对肝癌的p53基因治疗对改善肝癌的预后有重要意义。本文拟 就H101对体外、体内肝癌细胞生长的抑制作用及其与p53突变的关系 进行研究：同时将阿霉素与H101联用，探讨两者在杀伤肝癌细胞时的 协同作用。全部研究包括以下三部分。． 第一部分：重组腺病毒H101对体外肝癌细胞生长抑制的实验研究 目的：研究H101对体外肝癌细胞生长的抑制作用与细胞株p53基因突 变的关系．探讨Hj01的抑制作用与肝癌细胞p53及其p53通路 的r甜基因p2l“‘。表达的关系。 方法：所用细胞株分别为p53基因无突变的肝癌细胞株HepG2和 chain reactiOil，PCR) 胞L02。用聚合酶链反应(polymerase strandconformation 和单链构象多态性分析(Single 况。在}{；3终极稀释滴定法确定H101滴度后，分别以不同的空斑 of 形成单位／细胞(multiple 胞株，培养8天后用MTT法观察H101对细胞的杀伤作用。用5 组：然后分别在感染后第24、36小时取样，用免疫组化染色观 察细胞株p53、p21wA”基因表达的变化。 结果： (1)L02的p53基因无突变c 2 浙江丈学博士学位论文 (2)HlOl在MOI为100、10、 I、0．1、O．Ol时对BEL7404细胞