第二章蛋白质和主要必需氨基酸的测定.ppt

第二章 蛋白质和主要必需氨基酸的测定;第一节 概述;各种农产品中蛋白质的含量水平（%） ;蛋白质是生命的物质基础，它的含量是衡量农、畜、水产品品质和营养价值的重要指标。 测定植物各部分中蛋白质的含量，对其品质鉴定、品种选育、改善作物生育条件和调节作物体内新陈代谢和提高蛋白质含量等有重要意义。 对产品加工方式及其产品质量有影响。 在育种、食品和饲料等工作中常常需要测定蛋白质的含量。 ;氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。 氨基酸的分析测定是研究蛋白质、酶的化学组成及性质的重要手段。 动植物产品中的氨基酸以多种形式存在，大致可分为构成蛋白质的氨基酸和游离的氨基酸两种。 “第一、第二限制氨基酸”的赖氨酸和色氨酸，是必需氨基酸，但人类和动物自身无法合成，须从食物中直接吸收。 氨基酸的含量是衡量谷物、饲料蛋白质的重要标准之一。;蛋白质的分析方法很多，可分为两类： (1)利用蛋白质的共性，即含氮量； (2)利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸(碱) 性基团和芳香基团测定蛋白质含量。 最常用的方法是开氏（凯氏）法——测定含氮量。 粗蛋白质：开氏法测定结果中因其含有氨基酸、酰胺等非蛋白质氮，故称“粗蛋白质” 纯蛋白质：开氏法测定中，如果蛋白质用重金属盐等沉淀分离以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质的含量，则称为“纯蛋白质”。 ;籽粒中粗蛋白质的测定 同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法) 同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法);一、籽粒中粗蛋白质的测定;注意问题;开氏法是测定全氮量的经典方法，是丹麦人开道尔(J.Kjeldahl)于1883年用来研究蛋白质变化的，后来被用于测定各种形态的有机氮。 设备简单易得，结果可靠，为一般实验室所采用。至今尚无别的方法能与其比拟或将其取代。因此国际谷物化学协会(ICC)和美国分析化学家协会(AOAC)以及我国都把开氏法作为标准的分析方法。;开氏法是测定全氮量的经典方法，是丹麦人开道尔于1883年用来研究蛋白质变化的，后来被用于测定各种形态的有机氮。 开氏定氮法：(Kjeldahl determination)：在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液（硼酸）吸收，再以标准酸滴定，即可计算出样品中的氮量。;;开氏法也有缺点，主要是操作手续较繁，分析的速度较慢，试剂费用较高。 近年已出现几种以开氏法原理为基础的全自动或半自动的开氏定氮仪。 瑞典的Tecator公司生产的开氏1030分析仪(Kjeltec Auto 1030 Analyzer)、日本生产的kjel-Auto自动氮和蛋白质分析仪和丹麦FOSS公司生产的Kjel—FOSS自动蛋白质分析仪等。;;二、仪器设备;三、试剂;(1) 样品的消煮 称取烘干样品(过0.25mm筛) 0.3000 ~ 0.5000g置于50mL或100mL开氏瓶或消煮管中，加入混合催化剂1.8g，加几滴水湿润后，加5mL浓H2SO4，小心轻摇后(最好加塞放置过夜)，盖上小漏斗，将消煮管放置在消煮炉上，开始时用小火加热，待消煮液呈棕色时，可提高温度，消煮至溶液呈清亮带浅蓝色时，再加热约10min，取下冷却至温热时，将消煮液无损地转入100mL容量瓶中，冷却至室温后定容并放置澄清。 ;;（2）氮的测定 用移液管吸取澄清待测液5.00或10.00mL放入半微量定氮仪中进行定氮。同时作空白试验和核对试验。 ;凯氏定氮仪;;氮含量换算成蛋白质的系数，一般采用6.25，这是由蛋白质平均含氮16%为根据导出的值，但不同植物籽粒中蛋白质的含氮量有差异，故由氮换算为蛋白质的系数也稍有不同，P286。 以定量蛋白质为目的的总氮量测定中，开氏法分解时，硝态氮的部分氨化是不可避免的，因此蔬菜类特别是可能含有硝态氮的化合物的样品，需要用水杨酸固定硝态氮化合物，用开氏分解测定总氮量;同时用其他方法测定硝态氮的含量，再从总氮量减去硝态氮量后乘以蛋白质换算系数即得蛋白质含量。 ;本法测定的结果为粗蛋白质的含量。 如要测定纯蛋白质的含量，则样品应先用蛋白质沉淀剂碱性硫酸铜、碱性醋酸铅、200g·L-1 ~ 250g·L-1单宁或100g·L-1三氯乙酸等处理，将蛋白质从水溶液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋白质的换算系数即可得：“纯蛋白质”量。; 方法原理 蛋白质中的碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)的-NH2、咪唑基和胍基以及蛋白质末端自由氨基在pH=2～3的酸性缓冲液体系中呈阳离子状态存在，可以和偶氮磺酸染料类物质如橘黄G等的阴离子结合，形成不溶于水的蛋白质-染料络合物而沉淀下来，通过测定一定量样品与一定量体积的已知浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度