生化综合性实验报告.doc

本科学生综合性实验报告 ? 学号 姓名 学院 专业、班级 实验课程名称 教师及职称 开课学期 至 学年 学期 填报时间 年 月 日 云南师范大学教务处编印 实 验 室 实 验 时 间 2009.11.20-2009.12.18 实验序号及名称 实验十 酵母RNA 的提纯及其定性鉴定与定量测定 一、实验目的 1、学习生物大分子物质和提纯的基本原理、主要方法及步骤。 2、了解RNA提取的几种常用方法并掌握浓盐法提取RNA的原理和方法。 3、掌握几种定性鉴定所得RNA的原理与方法。 4、掌握两种定量测定所得RNA的原理和方法。 5、学习电泳技术的基本原理及其分类以及相关的应用。 6、学习离心技术在生物学实验中的应用。 7、学习光谱技术在生物学实验中的一些应用。 8、学习用生物材料提纯活性物质并进行定性定量分析的系列方法与技术。 二、实验内容 Ⅰ 提纯部分 浓盐法提取酵母RNA Ⅱ 定性鉴定部分 一、RNA基团鉴定 二、电泳分离鉴定 三、光谱鉴定 四、纯度鉴定 Ⅲ 定量测定部分 一、地衣酚法定量测定 二、紫外吸收法定量测定 三、实验原理 核酸提取的主要步骤 破碎细胞 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子 去除其它不需要的核酸分子 沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质 核酸分离纯化原则 保证核酸一级结构的完整性 排除其它分子的污染 简化操作，缩短时间，以减少各种有害因素对核酸的破坏 减少化学因素对核酸的降解(pH4-10) 减少物理因素对核酸的降解(机械剪切力 、 高温) 防止核酸的生物降解(DNA酶 、 RNA酶) 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、稀碱法和浓盐法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的,此法能较好地除去DNA和蛋白质,提取的RNA具有生物活性。 工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，浓盐法是用10％左右NaCl溶液，90℃提取3一4小时，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱(0．2％Na0H溶液)使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2．5利用等电点沉淀。用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。 酵母为提纯RNA的较好材料：酵母含RNA达2.67~10.0%，而DNA含量仅为0.03~0.516 %，因而，提取RNA多以酵母为原料。 提取RNA基本原理：细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取 RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。 RNA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH调至2.0～2.5，使RNA沉淀，进行离心收集。 RNA基团鉴定基本原理 RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸组分，加硫酸煮沸可使其水解，用硝酸银、地衣酚和定磷试剂可分别鉴定嘌呤碱、核糖和磷酸组分。 嘌呤鉴定： RNA 嘌呤 嘌呤银化物 （白色或红棕色） C、核糖鉴定： 四、实验设备及材料 五、实验方法步骤及注意事项 六、实验现象与结果 七、实验分析与讨论 八、实验总结 教师评分 100℃ ℃ ℃ H2SO4 RNA H2SO4 100℃ AgNO3