生化综合性设计实验论文.doc

中央民族大学生命与环境科学学院 生物化学综合性设计实验报告 2013年11月25日 CTAB法提取DNA 1.摘要 DNA是生命的遗传物质，英国学者F. Griffith[1]（1928年）以Stretococcus pneumonia （肺炎链球菌，旧称“肺炎双球菌”）对小鼠进行活体实验，为发现DNA是遗传物质打下了坚实的基础。1952年，A. D. Hershey 和M. Chase发表了证实DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验——噬菌体感染实验。至此，生命科学研究进入一个崭新的研究时代——DNA时代。为进一步认识和了解DNA的本质和特征，研究人员研究出多种分离提取DNA的方法，如氯化铯法、SDS法和一管法等, 并在动、植物和微生物的DNA 研究中运用。然而这些DNA提取方法有较高的成本以及较大的污染性。随着这一技术逐步改进,如Sagha-iM aroof等研发出十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法用于提取植物DNA等, 使得DNA的提取相对较为快捷, 提取的质量提高。 在众多的DNA 提取方法中, 发现CTAB 法是一种较为理想的提取植物DNA 的方法。根据实验室的设备以及药剂的具体情况，我组选择以菠菜为原料，利用操作简便且效果较好的CTAB法进行DNA的提取实验。 2.实验目的 （1）学习CTAB法提取植物DNA并掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法； （2）利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取植物叶片中DNA的操作方法提取菠菜DNA以及凝胶电泳法检验DNA的提取结果。 3.实验原理 （1）采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类），其对DNA的抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 （2）CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。该复合物在高盐的溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀（CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。 （3）CTAB溶液在低于15度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料中之前必须预热（65度），且离心温度不要低于15度。 λDNA/HindⅢ在1.0%琼脂糖凝胶电泳效果图； 4.实验仪器、试剂及其他 4.1仪器设备 研钵、离心机、水浴锅、天秤、灭菌锅、移液枪和电泳仪 4.2化学试剂与材料 4.2.1试剂 NaCl；EDTA；Tris；HCl；CTAB；0.7%疏基乙醇；液氮；2%CTAB抽提缓冲液；酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）；异丙醇（－20℃,预冷）；无水乙醇；氯仿-异戊醇（24:1）、液氮 4.2.2材料 菠菜 4.3 DNA提取缓冲液 4.3.1 1mol/L Tris-Cl的配制： 12.11g Tris碱；ddH2O 80ml；HCl 4.9 ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0，定容至100ml。 4.3.2 0.5M EDTA的配制： 在80ml水中加入18.01g EDTANa2.2H2O搅拌溶解，用NaOH调PH至8.0（约2gNaOH颗粒），定容至100ml。 4.3.3 5M NaCl 的配制： 称取29.22g NaCl，用ddH2O定容到100ml 4.3.4 2%CTAB提取液的配制： 最终浓度 试剂名 用 量 2% CTAB 2 g 1.4mol/L 5mol/L NaCl 28 mL 20mmol/L 0.5 mol/L EDTA pH 8.0 4 mL 100mmol/L 1mol/L Tris-HCl pH 8.0 10 mL 5.实验步骤 5.1 DNA提取 琼脂糖凝胶电泳 5.2制胶 （1）称取0.4g的琼脂糖，置于三角瓶中，加50ml 1×TAE作溶剂; （2）加热使琼脂糖完全溶解; （3）将胶槽洗净，两端用橡皮