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细胞结构综合性实验报告(共9篇) 细胞生物学综合性实验报告 植物原生质体的分离、纯化及融合 引言 原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。 分离原生质体采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组分，以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。 不同种植物的原生质体可在人工诱导条件下融合，所产生的杂种细胞，即异核体经过培养可再生新壁，分裂形成愈伤组织，进而分化产生杂种植株。由于进行融合的原生质体来自体细胞，故该项技术也叫体细胞杂交。原生质体融合能使有性杂交不亲合的植物种间进行广泛的遗传重组，因而在农业育种上具有巨大的潜力。在植物遗传操作研究中也是关键技术之一。 人工诱导原生质体融合可使用物理学方法，如运用细胞融合仪，在电场诱因导下实现融合，然而至今广为使用的仍是聚乙二醇（PEG）溶液引起原生质体的聚集和粘连，然后用高pH钙溶液相处理的化学方法（Kao等，1974）。该法应用分子量至为1500~6000的聚乙二醇（PEG）溶液引起原生质体的聚集和粘连，然后用高pH的钙溶液稀释时，就产生了高频率的融合，融合的频率和省略常与所有PEG的分子量、浓度，作用时间，原生质体的生理状态与密度以及操作者的细心程度有关。 1 材料、试剂与方法 1.1 材料 菠菜叶片,唐古特白刺愈伤组织,金盏菊花瓣。 1.2 试剂 1. 70％酒精。 2. 0.1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen 80。 3. 灭菌蒸馏水。 4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。 5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。 6. 酶液A 纤维素酶(cellulase，Onozuka R-10 2％ 果胶酶(13ectinase，Serva)1 % (若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。) 甘露醇0.6 mol／L CaCl2·2H2O 0.05 mol／L MES 0.1％ pH 5．8～6．2 7．酶液B 纤维素酶(Onozuka R-10) 2％ 离析酶(Macerozyme R-10)1％ 半纤维素酶(hemicellulase，Sigma) 0.2％ 甘露醇 0.4 mol／L CaCl2·2H200.1％ MES 8．PEG溶液 9. 高pH，高钙稀释液 PH5.8～6.2 1.3 方法 1.3.1 菠菜叶片和金盏菊花瓣的消毒处理 1. 取充分展开的叶片和花瓣，用自来水冲洗干净。(以下步骤均在超净台上进 行)。 2. 将叶片在0·1％升汞溶液中浸泡灭菌10min，中间摇动几次。取出后用无菌 蒸馏水漂洗5次 3. 将叶片移入大培养皿中，用吸水纸吸去上面的水珠。然后将叶背面朝上，小 心用镊子撕去下表皮。 1.3.2 原生质体的分离 4. 将撕去下表皮后的叶片放进预先放有酶液A的培养皿或带盖兰角瓶中，每 10ml酶液约放2g叶片。若叶片不易撕下下表皮，可用锋利的解剖刀将叶片切成约0.5mm宽的小条，放入酶液。 5. 将培养皿用石蜡膜带封口，在28℃条件下保温3～6h，中间轻轻摇动2～3 。 在倒置显微镜下检查，直到产生足够量的原生质体。 1.3.3 原生质体的纯化 6. 将酶解后的原生质体悬浮液用不锈钢网筛过滤到小烧杯中，以除去未酶解完 全的组织。 7. 将滤液分装在刻度离心管中，用600r／min的速度离心5min，使原生质体沉 淀下来。 8. 用移液管吸去上清液。将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.2 mol／L的CaCl2·2H2O 中。 9. 用注射糙伸长针头向离心管生部缓缓注入20％蔗糖溶液6ml，在600r／min 下离心5min。此步完成后，在两相溶液的界面之间将出现一层纯净的完整原生质体带，杂质，碎片将沉到管底。 10. 注射器吸出管底杂质和下部的蔗糖溶液及上部的CaCI2·2H2O溶液。 11. 离心管中留下的纯净原生质体用8ml 0.2 mol／L的CaCl2·2H2O悬浮。离心 离心5min，吸去上清液。再用培养基如法洗涤一次。 1.3.4 原生质体的融合 12． 将收集的两种不同材料的原