大鼠大脑皮质神经元的原代培养.doc

　　大鼠大脑皮质神经元的原代培养 【摘要】 目的 探讨大鼠大脑皮质神经元的培养 方法 。 方法 体外原代培养新生大鼠大脑皮质神经元, 应用 免疫细胞化学法及 电子 显微镜鉴定神经元。 结果 用神经基础培养基(Neurobasal-A)+B27培养的神经元纯度可达85%,生长状态较佳。 结论 以Neurobasal-A+B27培养的大鼠大脑皮质神经元活性较佳,纯度较高,是体外 研究 神经系统相关 理论 的良好模型。 【关键词】 大脑皮质; 神经元; 疾病模型，动物； 细胞，培养的 ABSTRACT: Objective To establish a primary culture method of the rat cortical neurons. Methods Primary culture of cortical neurons ade from nemunocytochemical and electronic micoscopic methods ary cortical neurons cultured ary cortical neurons cultured edium are active and rather pure and could be a good model for research of the nervous system. KEY odels,animal; cells,cultured; nuride 中枢神经系统的各种疾病如缺氧缺血性脑病、中风等对大脑皮质神经元均有不同程度的损伤,为研究其具体的作用机理及防治措施,建立合适的体内外模型至关重要。神经元原代培养是研究神经元形态结构及缺氧、缺血、中毒、外伤等病理因素 影响 的重要方法之一,为进一步的研究提供良好的原代神经元生物学材料,笔者探讨大鼠大脑皮质神经元的原代培养方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂和动物 　　神经基础培养基(Neurobasal-A)、胎牛血清(FBS)、B27(美国Gibco公司),左旋多聚赖氨酸(PLL,美国Sigma公司),DF-12(美国Hyclone公司),胰蛋白酶(美国Amerisco公司),NSE(Neuron-Specific enolase,神经元特异性烯醇化酶)多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司),UltraVision二抗试剂盒(美国Neomarker公司),其他试剂为国产 分析 纯。新生健康SD大鼠(lt;24 h)［福建医科大学实验动物中心,许可证号SCXK(闽)2004-002］。 　　1.2 皮质神经元原代培养 　　培养方法按 参考 　　2.3 神经元的超微结构 　　常规条件下培养4 d的神经元超微结构最典型,在电镜下可见其细胞膜完整,细胞质含有丰富的核糖体、粗面内质网等细胞器;核大,呈圆形或椭圆形,常偏位,核膜完整,染色质分布均匀(图3)。 　　3 讨 论 神经元体外培养是神经元发育分化、神经再生、神经系统疾病的发生机制等众多 研究 领域的重要模型,该模型具有 影响 因素单一、机体复杂因素干扰少和结果易 分析 等优点。因此神经元体外培养随之成为神经 科学 研究领域的关键技术。在神经元的体外培养过程中应注意以下几个方面。 　　3.1 培养液的选取 　　培养液是否合适是神经元培养能否成功的关键因素之一。血清中含有多种蛋白质、多肽、激素、生长因子等营养物质能够促进神经元贴壁生长及对体外环境的适应,但血清对胶质细胞的增殖作用很强。在神经组织的分离细胞悬液中,除了神经元之外,还有一些非神经元细胞是无法完全去除的,包括神经胶质细胞、脑脊膜细胞以及成纤维细胞等［4］。因此所采用的培养液应尽量减低非神经元细胞的存活力,提高神经元的纯度。 以往神经元的培养多采用DMEM培养基,并以抗有丝分裂剂阿糖胞苷来抑制神经胶质细胞的生长［3,5］,获得较高的纯度。但阿糖胞苷对神经元亦有一定的毒性,对其活性有不同程度的影响,并且大量胶质细胞死亡后的产物也不利于神经元的生长。故本实验选用富含神经元生长所需的各种营养物质的神经基础培养基,它被认为是神经元培养的良好基质［6］。本实验对神经元原代培养 方法 的改进之处在于:不用阿糖胞苷等有丝分裂抑制剂,培养中不是全程使用有血清培养基,而是以有血清培养基(含10%胎牛血清的DF12培养基)作为种植液,种植培养4 h后,全量换为无血清限定性培养基(Neurobasal＋B27)维持培养。由于培养中不加入阿糖胞苷,避免了其毒性作用。其中种植液中所含的血清能够保证细胞基本贴壁,提高了培养细胞的存活率;而维持液中的Neurobasal-A+B27添加物不仅能够促进原代培养神经元的存活和生长分化,还能抑制非神经元的分裂增殖［1］,因此大大提高了神经元的纯