组织切片免疫荧光染色的具体步骤.doc
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组织切片免疫荧光染色的具体步骤
1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理:石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后,进行抗原修复,然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次;???2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min???抗体染色:C孵育30min;?–??在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释),放在湿盒中,37???0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次,不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。???缓冲甘油封片–??分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2,0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。???镜检:在荧光显微镜下观察。???优点:方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。???缺点:敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。直接免疫荧光法的注意事项????对荧光标记的抗体的稀释:要保证抗体的蛋白有一定的浓度;???一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。???染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化;–??染色时间:从10 min到数小时,一般30 min;C的低温,延长染色时间。?C可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2?C),高于37?–??染色温度:多采用室温(25C 30 min效果好的多。?–??低温染色过夜较37 ???试验时需设置下列对照:–??自发荧光对照(空白对照):标本加0.01mol/L,pH7.4的PBS代替一抗。–??阳性对照:用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。–??特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。???若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。???一般标本在高压汞灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象;???经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。2 间接法又称为荧光抗-抗体法 需要两种抗体参与,即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用,但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。?–??可用来检测标本中未知抗原,也可检测血清中未知抗体。间接免疫荧光法操作步骤????标本的处理及非特异染色的封闭同直接法;???一抗染色:C过夜。?C作用30min或4?–??加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释,用0.01MpH7.4的PBS稀释),37???0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗);C湿盒避光作用30min。???? 加荧光标记的二抗抗体,37???0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸,在摇床上漂洗);???甘油缓冲液封片???镜检???优点:敏感性较高,比直接法高10倍左右;制备一种荧光标记抗体,可应用于多种一抗;???缺点:是参加反应的因子较多,产生非特异性染色的机会增多。间接免疫荧光法的注意事项????荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长 ,会使荧光减弱。???每次试验时 ,需设置以下三种对照:–??阳性对照:阳性血清+荧光标记物–??阴性对照:阴性血清+荧光标记物–??荧光标记物对照:PBS+荧光标记物???标本片需在操作的各个步骤中,始终保持湿润,避免干燥。???一抗和二抗应始终保持在标本片上,避免因放置不平使液体流失,从而造成非特异性荧光染色。
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