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免疫荧光非特异性染色的消除方法
免疫荧光非特异性染色的消除方法
一.非特异性染色的主要因素组织的非特异性染色的机理很
复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：（1）一部分荧光素
未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，
可与组织成分结合。
（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如
Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结
合。
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中
往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗
体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染
色。
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。
二.消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的
方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几
种：
（一）动物脏器粉末吸收法常用肝粉（猪.大白鼠或小白
鼠），其次是骨髓粉.鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入
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肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中
过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～
2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之
荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸
收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～
15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以
免消耗过多的抗体。
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗
体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原
时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos
氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3
次，12000r/min10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能
完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损
失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必
要再吸收一次。
【肝粉的制法】
（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理
盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理
盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
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（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍
量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕
先用2000r/min离心沉淀15min后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉
淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密
封，低温干燥保存。
（二）透析法荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白
质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，
液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸入0.02mol/ph
7.1～
7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS
内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液
中无荧即可（在荧光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法除游离荧光素可用2×46cm
柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15～18ml（按床
体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，
加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min，使游离荧光充分进
入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一
定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素