石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案.doc

石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案 石蜡标本固定、脱水、包埋方法 大鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定1-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm），置于塑料盒中并浸泡在4%多聚甲醛中固定，室温中固定时间12-48h，固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-1h左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅 北京大学出版社 2006年 70%： 1h-2h 80%： 1h-2h 90%： 1h-2h 95%： 1h-2h 95%： 1h-2h 无水Ⅰ：30min-60min 无水Ⅱ：30min-60min 二甲苯及水水酒精 1：1混合液 30min 二甲苯Ⅰ：30min 二甲苯Ⅱ：30min 石蜡Ⅰ： 1h 石蜡Ⅱ ： 1h 石蜡Ⅲ ： 1h 包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4℃ 注意事项： 固定液的种类：10%中性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温中固定12-48h能很好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4℃冰箱中固定24h-3d。有人建议中性甲醛40摄氏度固定2? 熔蜡温度65 ℃ 严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全，需退回无水酒精中返工。 经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二甲苯透明时间以具体时间而定。 注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。 组织石蜡切片 摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社 2006 载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。 石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56?58℃，切片水温为40℃左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方法），然后再移入热水中，这样可以使切片顺利展平；2、烤片时要注意：一般在62℃烤片30-60min，抗原较强的组织可在60摄氏度烤3?8h，抗原较弱的组织可于37℃的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置于 冰冻切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社 2006 冰冻切片的优点是能较完整的保持抗原性。组织细胞的某些抗原成分，特别是细胞膜抗原、受体抗原、酶及肽类抗原在石蜡切片处理过程中，可不同程度遭受破坏或失去抗原性，而冰冻切片能最大限度地保护抗原。缺点是冷冻过程中形态结构可能破坏，抗原易弥散。方法： 载玻片的处理：经明胶处理的载玻片。 将新鲜组织置于-25℃ 动物组织经4%多聚甲醛灌注内固定及其在4℃固定12-48h后，经40%蔗糖脱水沉底，吸干组织表面的液体后置于-25 取出切片后，应用电风吹冷风吹干或自然干燥。 其注意事项：1、温度不能太低，否则组织表面易出现冰渣；2、抗卷板的位置要适中，否则难以成片；3、贴片时动作轻而迅速，否则易出现褶皱；4、组织从液氮或-80℃ 石蜡切片免疫组化： 石蜡切片机切片，厚3?5um，充分晾干(3小时)。烤箱 62～64度1小时后并能较好粘片，可长期保存。 1. 烤箱 65度 5分钟。 2 石蜡切片脱蜡至蒸馏水。（脱蜡方法见后） 30分钟3 PBS 冲洗， 2分钟 x2 次。4 抗原修复：微波炉 30分钟（大火15min,中火15分钟）浸泡在PH 6.0的柠檬酸缓冲液里。 自然冷却到室温 PBS 冲洗，2分钟 x2次 5 3%H 2 O 2 室温孵育 10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS 冲洗， 2分钟 x2 次。6 5-10% 正常山羊血清 (PBS 稀释) 封闭，室温孵育 20 分钟，倾去血清，勿洗。 滴加 稀释一抗工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。 (用100微升抗体稀释液稀释1微升 PBS 冲洗，2 分钟 x3次。 滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 或室温孵育 30 PBS 冲洗， 2 分钟 x3次。 滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素（SABC） 工作液， 37 ℃ 或室温孵育 20 PBS 冲洗， 2分钟 x3次。 显色剂显色 5-15 分钟（ DAB ） 1ml蒸馏水+A ,B ,C各一滴。在显微镜下观察效果。 蒸馏水 2min×2次， SE轻度复染1min；必要时盐酸酒精分化数秒，见标本变粉红即可，分化后水洗5min.。 脱水；晾干，透明; 树胶封片。 （注意：盖玻片要先自己洗好晾干，高质量盖玻片可不用清洗，PBS冲洗时间因方式而异，浸泡时，时间可缩短。严格配制PH值要求的缓冲液） HE染色程序 30分钟 石蜡切片脱蜡后，冰冻切片水洗5min后可直接进行 1.苏木素： 3min 水洗：