第一章 蛋白质.ppt

BPG的生理作用 二、蛋白质的分子大小与分子量的测定 蛋白质的分子量的范围：6×103～1×106 Da。 根据化学组成测定最低分子量 凝胶过滤层析的洗脱曲线  （五）SDS法测定Mr 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。 当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。 平板电泳装置 垂直板电泳装置 在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。这种现象称为盐溶 五、蛋白质的分离纯化方法 1.透析：利用半透膜的选择通透性来纯化蛋白质等大分子物质的过程叫透析。 2. 超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质分子被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，有时要用切向流过滤法。 （二）利用溶解度差别的纯化方法 影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度。溶解度归根结底取决于他们本身的分子结构。 等电点沉淀技术：在等电点pH条件下，蛋白质为电中性，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技术。 pH和离子强度对β乳球蛋白溶解度的影响 盐析：当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。 有机溶剂分级分离法：引起蛋白质沉淀的主要原因是改变了介质的介电常数。 温度对蛋白质溶解度的影响：0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。 离子交换层析原理 离子交换层析原理 离子交换结合洗脱原理 亲和层析原理 （二）蛋白质纯度鉴定 电泳、沉淀、HPLC、N末端测序等 * * * * * * * * * * * * 七、蛋白质的含量测定与纯度 测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。 溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。 （一）蛋白质的含量测定 1. 双缩脲法 双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键，凡具两个以上肽键的物质均会发生双缩脲反应。 在碱性溶液中蛋白质可以与Gu2＋形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关。 2. 福林－酚法 福林－酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜形成复合物，此复合物以及芳香族氛基酸残基可以还原酚试剂而产生蓝色，再与标准蛋白质(通常采用牛血清白蛋内)比色定量。 福林—酚试剂法灵敏度高，但是如果样品和标准蛋白质的芳香族氨基酸差异较大时，会有较大的系统误差。 3. 紫外吸收法 蛋白质组成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，故可用280nm波长的光吸收即光密度的大小来测定一般蛋白质的含量。 4.考马氏亮蓝法 考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。 本法试剂配制简单，操作简便，是一种常见的蛋白质快速微量测定方法。 本章基本要求 1.掌握蛋白质的酸碱性质。 2.掌握测定蛋白质相对分子质量的常用方法。 3.掌握蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀的方 法和原理。 4.掌握蛋白质分离纯化的一般原则。 5.熟悉蛋白质分离纯化的常用方法。 6.了解蛋白质含量测定与纯度鉴定的常用方法。 * * * * * * * 味精即为谷氨酸的钠盐 * * * * * * * * * * * * * * * * * 水平式和垂直式平板凝胶电泳装置 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS） 0.5 1.0 kD 330 220 67 60 36 18.5 kD 94 67 43 30 20.1 14.4 Mol mass kD 300 200 100 80 60 50 40 30 20 10 Migration (Rf) Pharmacia: Molecular Markers