流式细胞术实验方法及应用.ppt

1、空白对照用缓冲液（PBS）代替单克隆抗体进行实验2、阳性染色对照用现有试剂和方法检测已知表达某种特异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时，可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细胞。六、荧光染色对照设置(空白对照、阳性对照、阴性对照、

同型对照)第28页，课件共77页，创作于2023年2月3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。4.同型对照与染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE第29页，课件共77页，创作于2023年2月七、荧光补偿流式细胞分析中常需要两种或两种以上不同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补偿。第30页，课件共77页，创作于2023年2月第31页，课件共77页，创作于2023年2月第32页，课件共77页，创作于2023年2月八、数据分析流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意门和四象门等。任意门、矩形门线性门四象门第33页，课件共77页，创作于2023年2月多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。淋巴细胞T淋巴细胞（CD3+）CD3+CD8-IFN-rIL-4（CD4+）第34页，课件共77页，创作于2023年2月数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为单参数直方图和双参数散点图。第35页，课件共77页，创作于2023年2月参数的意义:FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大，散射光越强，细胞越小,散射光越弱;SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反映细胞颗粒性程度大小。单参数直方图X轴代表荧光或散射光的强度，Y轴代该道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数；双参数散点图X轴和Y轴均代表散射光或荧光的强度.SSCFSC第36页，课件共77页，创作于2023年2月九、流式细胞术的应用及标记方法

第37页，课件共77页，创作于2023年2月1、DNA含量分析意义：肿瘤的早期诊断，肿瘤的良恶性判断，观察细胞的增殖状态及细胞周期分布。正常生物细胞，DNA含量随着细胞增殖周期时相而发生变化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C）G2/M期（4C）。2C2C→4C4C第38页，课件共77页，创作于2023年2月FCM进行细胞周期DNA含量分析时，需要对DNA进行染色，DNA染料（PI）与DNA结合具有特异性，有一定量效关系，即DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA吸收荧光分子多少成正比。FCM分析一个细胞群周期与DNA倍体时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1、S、G2/M三个细胞峰。G2/M(4C)G0/G1(2C)S(2C→4C)G2/M(4C)第39页，课件共77页，创作于2023年2月方法：细胞悬液（1*106）70%冰乙醇4oC，24h离心去固定液PBS洗2次RNase30minPBS洗1次PI避光,30min上机采集10000细胞，MultiCycle软件进行细胞周期分析G0/G1(2C)S(2C→4C)G2/M(4C)第40页，课件共77页，创作于2023年2月当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNA倍体及S期的改变（异倍体）恶性肿瘤细胞增殖周期的判断：S10、G2/M15或S20、G2/M5第41页，课件共77页，创作于2023年2月白细胞分化抗原（CD分子）的命名：1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群(ClusterofDifferentiation，CD)，进行编号、命名，即为