生物化学实验：第二次实验.doc

Folin-Wu法定量测定血糖的含量 实验目的 1、掌握Folin－Wu法测定血糖含量的原理和方法。 2、学会制备无蛋白血滤液。 3、掌握7200型可见分光光度计的使用方法。 二．实验原理 葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基， ，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）而沉淀。 Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+ （Cu2O） 无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应, Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物—钼蓝 。 Cu2O+酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物 OD420比色 血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。 三．实验仪器 1、25mL血糖管×3支； 2、血糖管橡胶塞×3个； 3、100mL锥形瓶×2个； 4、漏斗架×1个； 5、普通漏斗×2个； 6、水浴锅×1个； 7、电炉×1个； 8、移液管 1mL×2支; 2mL×3支;5 mL×2支;10 mL×1支; 9、滤纸×1盒； 10、吸耳球×2个； 11、7200型分光光度计×1台; 12、表面皿×1个 四．实验试剂 1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） 2、10%钨酸钠溶液 3、0.33mol/L硫酸溶液 4、碱性硫酸铜溶液 5、酸性钼酸盐溶液 五．实验步骤 1、无蛋白血滤液的制备： 用5ml移液管吸取全血（已加抗凝剂）5ml,缓缓将1ml放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。 再加0.33mol/L 硫酸1ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置5～15分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO41-2滴）。 用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。 2、血糖的定量测定： 取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml酸性钼酸盐溶液。 一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。 六．实验结果 空白管 标准管A0 样品管A1 OD420 0.000 0.111 0.145 OD420 0.000 0.115 0.152 OD420 0.000 0.121 0.157 OD平均 0.000 0.116 0.151 按下式计算100ml全血中所含血糖的含量 m=A1/A0×C0÷0.1×100 =0.151/0.116×0.1÷0.1×100 =130.17mg 式中: m=100ml全血中含血糖毫克数 ; C0=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml） A1=样品液光吸收值 ; A0=标准液光吸收值 0.1：1ml无蛋白血溶液相对于0.1ml全血 七．实验分析 （一）注意事项： 1.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀 2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加入10％硫酸1-2滴，待暗棕色后再过滤。 3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。　如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。 （二）思考题： 1．实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？ 答：1）加入的试剂以及样品的量 2）加入硫酸和钨酸钠时是否一边加一边摇晃 3)如果加完规定量的试剂之后血液还是鲜红色，可能的原因是血液中的抗凝剂加地太多，这是应该再滴加一到两滴硫酸，不可以在血液还是鲜红色的时候就开始过滤，否则得到的滤液将是有红色的而不是无色透明的； 4）水浴加热八分钟后要用流动的水进行冷却，冷却后要进行充分地混匀，混匀时也可能会造成实验误差，可能混的不充分或者是再混匀的过程中，还没混匀之前，会有液体从血糖管口流出，会使浓度升高。 5）过滤是的实验操作是否正确也影响到实验结果 2．实验中，血糖管有什么作用？ 答：血糖管接近底部处有一细小部分，可以避免还原生成的氧化亚铜被空气中的氧再氧化，降低实际结果 。 3．实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？ 答：加快冷却，防止亚铜离子氧化。