蓝莓常见品种鉴别技术规程.docx

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蓝莓常见品种鉴别技术规程

1范围

本规程规定了基于简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）标记分析与构建12个蓝莓常见品种的DNA指纹图谱过程中的的试剂配置、DNA提取、PCR扩增、PCR产物检测等技术要求。

本规程适用于对12个蓝莓常见品种的快速鉴定及差异分析。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1PCR

聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR)，是以DNA为模板，在DNA聚合酶，引物，dNTP的共同参与下使目标片段扩增并用于检测分析。

3.2SSR标记

根据基因组测序得到的序列，在SSR序列两端的序列设计特异性引物，利用PCR技术进行扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并鉴定的大小不同的扩增产物片段。

3.3指纹图谱

利用不同SSR标记，在不同蓝莓品种提取的DNA中进行PCR扩增与凝胶电泳检测，对得到的不同大小的DNA片段进行统计分析，整理得到的指纹图谱。

3.4品种鉴定

对供试材料进行DNA提取，利用SSR标记进行PCR扩增与凝胶电泳检测，并进行统计分析，与构建好的指纹图谱进行比对鉴定的研究方法。

4试验准备

4.1仪器与试剂

见附录A。

4.2溶液配置

见附录B。

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4.3引物信息

用于构建指纹图谱与品种鉴定的引物的相关信息见附录C。

5操作程序

5.1样品准备

选取蓝莓新鲜叶片，-20℃运输，-80℃进行长期保存，本研究中所用蓝莓参照品种见附录D。

5.2DNA提取

对于采集的新鲜嫩叶，使用试剂盒（TIANGEN）进行DNA提取。根据操作指南，步骤如下：

（1）处理材料：取植物新鲜叶片20mg，加入液氮充分碾磨后转移至1.5ml离心管中，加入400μl缓冲

液LP2和6μlRNaseA(10mg/ml)，漩涡震荡1min，室温放置10min。

（2）加入130μl缓冲液LP2，充分混匀，漩涡震荡1min。

（3）12,000rpm(~13,400)离心5min，将上清移至新的离心管中。

（4）加入1.5倍体积的缓冲液LP3（例如500μl的上清液加750μl缓冲液LP3），立即充分振荡混匀

15sec。此时可能会出现絮状沉淀。

（5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000

rpm(~13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

（6）向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000

rpm(~13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

（7）重复操作步骤6。

（8）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于

室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（9）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，

室温放置2-5min，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中，以待检测。

5.3DNA质量检测

（1）琼脂糖凝胶电泳检测DNA

取5μL提取的DNA原液，在100V的电压下，用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳20min左右，取出凝胶，在紫外凝胶成像系统上观察电泳条带，观察条带是否单一，是否有拖尾。

（2）酶标仪检测；

吸取1.5μL提取的DNA原液，通过NanoDrop进行检测，鉴定DNA浓度和质量，是否有RNA污染，蛋白质或者酚污染。

5.4PCR扩增

5.4.1反应体系

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SSR的反应体系：正反向引物（10μmol/L）各1μl、2*TaqPCRMasterMix8μl、模板100ng、添加灭菌超纯水至20μl。

5.4.2反应程序

94℃预变性10min；94℃变性40s，52℃退火70s，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min。

5.5PCR产物检测

扩增产物用12%聚丙