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ELISA实验操作中常见问题分析 由于酶联免疫试验具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝 ELISA() 炎、爱滋、优生优育等。虽然洗板只是实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我ELISA 们必须对影响实验结果各因素有一定的认识。优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。尤其是花板现象(就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的值却明显偏高)是各个厂家洗板OD 机调试中经常遇到的问题。现将实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善ELISA 洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。 标本及采集、贮运因素 1 严重溶血，以为标记的测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物 HRP ELISA 显色造成假阳性;混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净;如有细菌污染，菌体中可 能含有内源性，也会产生假阳性反应;标本凝固不全，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未HRP 开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在测定过程中可以形成肉眼可ELISA见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果;采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染;塑料试管能吸附抗 原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。 血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般说来，在天内测定的血清标本可放置于?，标 5 4本在冰箱中保存时间过长导致血清聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需,?保存。IgG 20冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次 检测，宜少量分装冰存;最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管;并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关;、酶抑制剂(如ODEDTA )可抑制系统中辣根过氧化物酶活性;血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或NaN3ELISA 标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。 、试剂的影响2 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏 ELISA 来衡量反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包ELISA 被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度， 科学地对待反应结果。基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性，就试剂盒来讲，第HCV-ELISA 一代产品为合成肽抗原，主要是特异性抗原决定簇的肽片段;第二代产品包被的抗原既有基因工程HCV 抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了的核心区片段;第三代产品基本上采用HCV 了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的特异性抗原。第三代试剂的敏感HCV 度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下: 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达 系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点: 分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸;而利a. 用基因工程制备的抗原，分子量更大。 稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效b. 期只有个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。3-4 基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的c. 灵敏度，提高检出率。 纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。d. 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原 有以下特点:分子量太小;一般只含有一个抗原决定簇;纯度高;稳定性差。 a.b.c.d. 国内乙肝两对半试剂厂家较多;不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同 厂家试剂的特异性和敏感性分别为存在较大差异。有的厂家酶标板孔间值差 89.4%—99.3%,78%—89%A大于;标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。15% 选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。 选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参? 比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的主要依据。