ELISA实验操作中常见现象理论探讨.doc

ELISA实验操作中常见关键词理论探讨（一） 关键词1：乳化与去乳化 在ELISA实验操作中，经常会遇到样本乳化，导致检测结果较差的现象。 乳化属于胶体化学范畴，是指一种液体以细小液滴（分散相）的形式分散在另一不相溶的液体（连续相）中，这种现象称为乳化现象，生成的这种液体称为乳状液或乳浊液。乳化液可分为“水包油”和“油包水”两种类型。 在液—液萃取过程中，往往会在两相界面产生乳化现象，这种现象对于萃取过程的进行通常是不利的，给分离带来麻烦，即使采用离心机，也很难将两相完全分离，例如实验操作中形成的是油包水形式的乳状液，而我们需要的目标物为油相，则造成油相体积减少，以致油相不够取的现象，给实验带来不便；如果实验中形成的是水包油形式的乳状液，而我们需要的目标物为油相，则会造成油相的药物浓度升高，造成回收率上升，出现假阳性的现象。因此必须设法破除。 乳化和去乳化的本质是表面现象，从热力学关系推演可知乳化的产生是一种自发过程，而乳状液本身又是一个不稳定的热力学系统。乳化液可分为“水包油（O/W）”和“油包水（W/O）”两种类型，出现何种类型的乳化液，主要由表面活性剂的性质决定，如果表面活性剂的亲水基团强度大于亲油基团，则易形成O/W型乳状液；如亲油基强度大于亲水基，则易形成W/O型乳浊液。一般常用HLB数（亲憎平衡值）来表示，一般来说，HLB数愈大，亲水性愈强，形成O/W型乳状液；HLB愈小，洒油性愈强，形成W/O型乳状液。 乳状液的消除方法甚多，有过滤分离、化学法（加电解质破坏双电层）、物理法（加热、稀释、吸附等）、顶转法（加入其他表面活性剂）等，一般实验中采用物理法进行操作，可减少实验误差.比如稀释法（硝基呋喃类药物代谢物实验操作中如果乙酸乙酯不够取的情况下加入一定量的乙酸乙酯）或者加热法（在正已烷与复溶液形成的乳状液，先去除正已烷层后60度水浴除去乳化层）。 关键词2：振荡提取 ELISA实验操作中最常见的提取手段就是振荡提取，提取的本质是利用的萃取进行液-液分配或液-固分配的过程。萃取过程一般分三个过程：①.混合，萃取剂与原物密切接触；②.分离，萃取相与萃余相分离；③.目标相回收，把萃取相从混合溶剂中分离。 一般萃取步骤利用间歇操作，也可以进行连续操作。在ELISA实验中，间歇操作的回收率优于连续操作。间歇操作也在一定程度上可以防止有机溶剂过分膨胀而导致的喷出现象。 一般说来，由于错流萃取过程能使萃取剂与萃余相充分接触，平衡常数能在最短的时间内达到平衡，所以错流萃取的效果优于其他简单萃取过程。而且错流萃取能很好的便平衡常数保持在一个程度，对操作的平行性有所帮助。所以在ELISA实验操作中都是利用振荡提取进行操作的。 综上，在做ELISA实验操作中利用间歇性的上下往复振荡操作进行提取就可以达到多级错流萃取的目的。 关键词3：离心分离 在ELISA的前处理操作中，常会遇到固-液或液-液需要分层的情况，在实际操作中一般利用静置分层或离心分离进行两相分层。离心分离相对于静置分离来说有速度快、分离效果好、杂质干扰少等诸多优势。故在ELISA实验操作中都是利用离心分离进行操作，主要设备是离心机。 离心分离对那些固体颗粒很小或液体黏度很大，过滤速度很慢，甚至难以过滤的悬浮液十分有效，对那些忌用助滤剂或助滤剂无效的悬浮液的分离，也能得到满意的结果。离心分离不但可用于悬浮中液体与固体的直接分层，也可用于两种互不想溶的液体的分离，如前处理常用到的液-液萃取，以及不同密度固体或乳浊液的分离。离心分离可分为三种形式：①.离心沉降，利用固液两相的相对密度差，在离心机中进行分离操作；②.离心过滤，利用离心力并通过介质，在离心机中进行分离操作；③.离心分离与超离心，利用不同溶质颗粒在液体中各部分分布的差异，分离不同相对密度液体的操作。一般在ELISA前处理操作中用到的是离心沉降与离心分离两种。 离心沉降的基础是固体的沉降，离心分离的基础是两种溶剂在任何时候均不互溶，且有一定的密度差。当粒子在无限连续流体是沉降或分离时，受到两种力的作用，一种是连续流体对它的浮力，另一种是流体对运动粒子的粘滞力。如果这两种力达到平衡，粒子将保持匀速运动，分离将会受限制。离心的效果主要是由离心分离因数Fr（又称离心力强度或离心力）来定量评价： Fr = ω2r/g =11.19* (rpm/1000)2 * r *g Fr表示了粒子在离心机中产生的离心加速度与自由下降的加速度之比；Fr越大，越有利用分离。一般实验操作要求的3000g都是表示为离心力。对于不同的离心机来说有不同的转数可以达到该离心力，如以实验室常用的安亭的50A或50D型号的离心机来说，该离心机的离心半径约在13cm到15cm之间，根据样本体积多少有所差异。那么换算下来，转速要达到4300rp