反相高效液相色谱法测定卷柏中穗花杉双黄酮的含量.docx

反相高效液相色谱法测定卷柏中穗花杉双黄酮的含量 柏树是柏树科的一种干燥的全草，也被称为九死还魂草，生长在干燥的岩石上。它对收缩止血、出血和打破血液有显著影响。穗花杉双黄酮(Amentoflavone)是卷柏属植物中的一种特征化学成分。笔者采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定贵州和湖南卷柏药材中穗花杉双黄酮的含量方法灵敏准确,可为选择卷柏道地药材提供依据。 1 材料表面 1.1 超声清洗器设备 LC-2010A型高效液相色谱仪,包括CLASS-VP色谱工作站、UV-2010A型检测器、自动进样器、柱温箱、四元低压梯度泵(日本岛津公司);KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);AL104型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。 1.2 试剂均为分析纯 穗花杉双黄酮对照品(河南大学天然药物研究所自制,纯度:98%);甲醇为色谱纯,水为高纯水,其余试剂均为分析纯;卷柏药材于2007年7月分别采于贵州都匀和湖南,由河南大学天然药物研究所袁王俊副教授鉴定为卷柏科卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring的干燥全草。 2 方法和结果 2.1 流动相、检测波长 色谱柱:Purospher star RP-C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液(65∶35);流速:0.8mL·min-1;柱温:25℃;检测波长:337 nm。理论塔板数按穗花杉双黄酮峰计算应6 000;穗花杉双黄酮峰与周围峰的最小分离度R1.5;保留时间为22.232 min。色谱见图1。 2.2 对照溶液的制备 精密称取穗花杉双黄酮对照品1.00 mg,加甲醇定容至25mL,配制成浓度为0.04 mg·mL-1的对照品溶液。 2.3 容量瓶液压的制备 取贵州和湖南2个产地的药材各适量,干燥后粉碎,过60目筛,分别精密称取0.030 g,置于10 mL容量瓶中,加甲醇适量,冷浸过夜。超声40 min,放冷,用甲醇定容至10 mL,摇匀,分别用0.45μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液。 2.4 穗花杉双黄酮与峰面积积分回归试验 分别精密吸取对照品溶液3、5、7、9、12、15μL,注入液相色谱仪,保留时间为19.82 min。以穗花杉双黄酮进样量(X,μg)为横坐标,峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程为Y=6×106X—6 312.7(r=0.999 9)。结果表明,穗花杉双黄酮进样量在0.04~0.60μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。 2.5 精密度测试 精密吸取同一对照品溶液10μL,重复进样5次,分别测定峰面积。结果,峰面积的RSD=1.9%,表明仪器精密度良好。 2.6 进样峰面积测定 精密称取贵州产卷柏0.030 g,共6份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,各进样10μL,测定峰面积,计算。结果,RSD=0.50%,表明方法重现性良好。 2.7 稳定性试验 取贵州产卷柏同一供试品溶液,每隔2 h进样1次,测定并记录峰面积。结果,RSD=0.20%,表明供试品溶液在10 h内稳定性较好。 2.8 加样回收率试验 精密称取已知穗花杉双黄酮含量的贵州产卷柏样品9份,分别加入一定量的对照品,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,每次进样10μL,测定并计算加样回收率,结果见表1。 2.9 样品含量测定 取贵州和湖南2个产地的药材各适量,干燥后粉碎,过60目筛,分别精密称取0.030 g,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件进样10μL,按外标法以峰面积计算样品含量,结果见表2。 3 流动相的选择 双黄酮广泛存在于植物中,具有清除自由基、保护脂质过氧化、降低微血管通透性等作用。双黄酮作为卷柏类药材的特征性成分,测定其含量具有特别的意义。有报道,双黄酮的含量测定采用RP-C18柱,经梯度洗脱后峰形拖尾严重,并且有2个双黄酮完全没有分开;换用其它洗脱条件和反相柱,分离均未获成功。故大多数研究习惯采用正相柱测定双黄酮,但其梯度洗脱的程序繁琐,且耗时长。笔者通过反复摸索,选择RP-C18柱作为固定相,以甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相,达到了较满意的分离效果。 本试验测得贵州和湖南卷柏中穗花杉双黄酮的含量分别为0.19%和0.51%,前有试验测得西藏产垫状卷柏所含穗花杉双黄酮的含量为0.36%,可见同种卷柏不同产地之间的穗花杉双黄酮的含量相差较大,其规律有待进一步研究探讨。