中科院植物基因工程课件-- 4-1目的基因的获得.pdf

第四章 目的基因的获得 －目的基因的分离克隆和方法 功能基因的4个特性： 1.基因有固定的一级结构 2.每个基因在染色体上占有特定的位置 3.每个基因有特定的转录模式 4.大部分基因都有功能 基因的分离与克隆方法： 1.根据基因的功能蛋白分离目的基因 2.根据mRNA特异性分离目的基因 3.根据DNA的插入作用分离目的基因 4.基因文库技术分离目的基因 5.图位克隆分离目的基因 6.酵母双杂交系统分离目的基因 第四章 目的基因的获得 一.根据基因的功能蛋白分离目的基因 （一）技术路线 （二）相关技术 （三）基因分离 （一）技术路线 分离纯化功能蛋白 蛋白质一级结构分析（AA序列测定） 制备抗体 根据AA序列合成寡核苷酸片断 筛选表达型基因文库 PCR引物 寡核苷酸探针 DNA DNA PCR扩增 筛选基因文库 或cDNA 或cDNA （二）相关技术 1.蛋白质分离纯化及双向电泳 2.蛋白质氨基酸序列分析 蛋白的分离纯化及双相电泳 一. 分离纯化的一般程序 • 样品的前处理： 从组织或细胞中把蛋白溶解出来 • 粗分级分离：与杂蛋白分离开 • 细分级分离：进一步纯化 二. 蛋白分离纯化的方法 分离纯化蛋白的依据 • 蛋白分子的大小 • 溶解度 • 电荷 • 吸附性质 • 对配体分子的生物学亲和力 方法 • 透析 • 密度梯度离心 • 凝胶过滤 • 等电点沉淀 • 蛋白的盐溶和盐析 • 电泳 • 离子交换层析 • 吸附层析：羟磷灰石（吸附剂） • 亲和层析： •凝集素亲和层析 • 高压液相层析 •免疫亲和层析 •金属亲和层析 2. 透析法 • 透析袋 • 缓冲液 SDS • 电泳槽 3. 等电聚焦电泳（IEF） The Principle of Isoelectric Focusing. A pH gradient is established in a gel before loading the sample. (A) The sample is loaded and voltage is applied. The proteins will migrate to their isoelectric pH, the location at which they have no net charge. (B) The proteins form bands that can be excised and used for further experimentation.