中科院植物基因工程课件第四部分 4-2 目的基因的获得.pdf

第四部分 目的基因的获得 －目的基因的分离克隆及其方法 第四章 目的基因的获得 二.根据mRNA的特异性分离目的基因 （一）mRNA differential display PCR (DDRT PCR) 2 差式显示的基本策略是通过反转录与PCR扩增 mRNA 中特定的一小部分，用DNA序列分析胶（6 ％－8 ％）同步分离显示扩增产物以进行比较。 首先要以5’ －T （n ）MN—3‘ (3’ 固定引物．3’anchored Primer ，其中n ＝10一20 ，M ＝dA ／dC ／dG ，N ＝dA ／dC/dT ／ dG ）作引物，将待比较的mRNA进行逆转录得到单链 cDNA ，由于该引物具有poly(dT ），故可与mRNA 的3’- poly(A)结合，而另外两个碱基MN的作用是使它定位在 poly(A)5‘端．并使它只介导约1 ／12的mRNA 的逆转录。 逆转录之后，以单链cDNA为模板，立即进行PCR ， 3’端引物就是上述3‘ 固定引物，5’瑞引物是10 －13个碱 基的随机引物。 3 在细胞A中表达而不在细胞B中表达的基因．若引物 合适，就可能在A的PCR产物中发现相应的基因片段，而 不会在B的PCR产物中发现该片段。 5’端引物较短，特异性较低．能以相对较高的机率 与cDNA 5‘端结合，从而保证每一对引物都能扩增出适 当数量的DNA片段(约50 －150条)。若片段数过少，要对 全部mRNA进行比较就必须合成大量引物，进行大量PCR； 若片段数过多，又会增加分离纯化的难度。 当每次PCR扩增50— 150个片段时，通过对12个3’引 物和25个5’引物的不同组合，可以在95％的情况下分析 15000个不同的基因，基本包括单个细胞所能表达的全 部基因数。 4 ⑶ cRNA 差式显示法 除了极少数特例( 如组 蛋白基因)之外，几乎所有 的真核基因mRNA 分子的 3-末端，都带有一段多聚 的腺苷酸结构，即通常所 说的poly(A)尾巴。 5 P.Liang等人设计合成了全部12种 不同的引物，用以反转录mRNA， 合成第一链cDNA。这种引物通常 叫作3-端锚定脱氧核苷酸引物， 并用5-T11MN或5-T12MN通式 表示。其中M为除了T 以外的任何 一种核苷酸（即A 、G或C ），而 N则为任何一种核苷酸（即A 、G、 C或T ），故MN共有12种不同的 排列组合方式。 6 7 DDRT-PCR 的主要步骤： Ⅰ.从不同发育阶段或不同基因型的 细胞群体中分离 mRNA，并以 3锚 定引物作为反转录的引物，合成第一 键cDNA； Ⅱ.用5随机引物和某个3端锚定引 物对扩增第一链(掺入32p-dNTP)； Ⅲ.用 DNA 变性测序胶分离扩增产 8 物，X 光片曝光后检测差别条带； Ⅳ.回收特异性差别条带； Ⅴ.用同一引物对扩增已回 收的DNA 条带； Ⅵ.用 Northern ，Southern 及测序法分析所得的条带； Ⅶ.以该DNA 片段做探针， 筛选全长cDNA 或核基因。