结核分枝杆菌、厌氧菌及其它微生物的检测.ppt

结核分枝杆菌、厌氧菌及其它微生物的检测苏州大学附属第二医院检验科谢小芳实验程序一、实验目的二、理论内容三、实验内容四、实验报告实验目的掌握结核分枝杆菌形态和染色结果报告。熟悉厌氧菌培养和鉴定流程。结核分枝杆菌形态观察

（1）标本处理化学处理将痰液标本加入等量的6%次氯酸钠后，消化作用30min后离心处理；高压处理痰液标本经121℃,30min高压消毒后离心处理（2）涂片取洁净玻片，在酒精灯上烤去油脂成分，做好标记，用吸管吸取离心后标本沉渣，制成20mm×15mm大小的厚膜涂片。自然干燥后，固定，进行染色。结核分枝杆菌形态观察

（3）染色抗酸染色法金胺“O”荧光染色法结核分枝杆菌形态观察

抗酸染色原理：结核菌、麻风杆菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质之皮膜而不易着色，但一经着色后，酸性酒精的作用亦是不容易把它脱色。利用此特性并以增强的染色液予染色，然后再以酸性酒精加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色(红色)，也就易于鉴别。试剂成份：试剂组成主要成份1、石碳酸复红溶液碱性品红、苯酚2、酸性酒精溶液乙醇、盐酸3、亚甲基蓝溶液亚甲蓝抗酸染色染色步骤：初染：将固定好的涂片置于染色架上，滴加数滴石炭酸复红溶液，作用10min;脱色：用3%盐酸酒精脱色，直至涂片无红色染液脱下为止，流水冲洗；复染：用亚甲蓝溶液复染1min，水洗。待干后油镜下观察结果。抗酸染色抗酸染色结果观察油镜下观察涂片，在淡蓝色背景下可见染成红色细长或分枝状杆菌，此为抗酸染色阳性细菌。抗酸染色结果报告—：观察300个视野未发现抗酸杆菌；±：300个视野内发现1-2条抗酸杆菌；1+：100个视野内发现1-9条抗酸杆菌；2+：10个视野内发现1-9条抗酸杆菌；3+：每个视野内发现1-9条抗酸杆菌；4+：每个视野内发现9条以上抗酸杆菌。金胺“O”荧光染色法原理：抗酸性菌用荧光染料AuramineO(金胺O)染色后，用含有紫外光源的荧光显微镜检查，将会发出闪亮的橘黄颜色，这种方法可用低倍镜检，因此能更快速找出抗酸性菌。试剂成份：试剂组成主要成份1、金胺O染色液金胺O2、酸性酒精溶液盐酸、乙醇3、复染液高锰酸钾金胺“O”荧光染色法染色步骤：荧光染色：涂片固定后，滴加荧光染色金胺“O”染色10-15min，水洗；脱色：用0.5%盐酸酒精脱色3-5min，至无黄色染液脱下为止，水洗；复染：用0.5%高锰酸钾复染2min，水洗。待干后，用荧光显微镜高倍镜下检查。金胺“O”荧光染色法荧光染色结果观察高倍镜下观察涂片，在暗视野背景下抗酸杆菌呈黄绿色或橙黄色荧光。荧光染色结果报告—：观察70个视野未发现抗酸杆菌；±：70个视野内发现1-2条抗酸杆菌；1+：50个视野内发现2-18条抗酸杆菌；2+：10个视野内发现4-36条抗酸杆菌；3+：每个视野内发现4-36条抗酸杆菌；4+：每个视野内发现36条以上抗酸杆菌。厌氧菌的分离与鉴定厌氧菌标本的采集涂片与染色标本接种耐氧试验鉴定试验（一）厌氧菌标本的采集1、脓胸及未破溃的脓肿2、肺分泌物和痰标本3、尿液标本4、血液标本5、窦道及深部脓肿等标本厌氧菌的分离与鉴定（二）涂片与染色镜检不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同时也能为鉴定厌氧菌提供参考和依据。如厌氧菌芽胞在菌体极端且大于菌体呈鼓槌状，是破伤风梭菌的特征。厌氧菌的分离与鉴定（三）标本接种标本接种3个血琼脂平板，分别置于有氧、无氧和含5-10%CO2的环境中培养。若只要求检测厌氧菌，只需接种1个厌氧血琼脂平板。厌氧菌的分离与鉴定（四）耐氧试验当厌氧血平板上有细菌生长时，为了确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。挑取菌落分别转种2块需氧血琼脂平板和1块厌氧血琼脂平板，然后将平板分别放置在需氧、厌氧和CO2环境中培养。厌氧菌的分离与鉴定厌氧菌的分离与鉴定A区：在厌氧环境中生长，而在需氧和CO2环境中不生长，为专性厌氧菌；B区：在需氧、厌氧环境中均能生长，为兼性厌氧菌；C区：在厌氧环境中不生长，为专性需氧菌；D区：在需氧、厌氧环境中均不生长或生长不佳，而在CO2环境中生长良好，为需CO2菌。厌氧菌的分离与鉴定（五）鉴定试验最终鉴定需要进行生化反应及终末代谢产物等检查。生化试验主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵