分枝杆菌微生物学检验.doc

分枝杆菌 1. 分枝杆菌属 Mycobacterium ： （1）一类细长、略带弯曲、呈分枝状生长细菌，革兰染色阳性，无芽胞、无荚膜； （2）抗酸染色阳性，故又称抗酸杆菌； （3）营养要求较高，常用罗琴培养基； （4）生长缓慢，2~8周后方可见菌落； （5）G+C mol%为62%~70%； （6）由于结核分枝杆菌的耐药和AIDS发病率呈上升趋势，结核病成为危胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题。 2. 主要致病种类：人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌 3. 分枝杆菌属分类 （1）典型结核分枝杆菌：人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌 （2）非典型分枝杆菌： （3）其他：副结核分枝杆菌、麻风杆菌、鼠麻风杆菌 4. 结核分枝杆菌（1）临床意义 A. 本菌抵抗力强，可存活6~8月，随着漂浮于空气中的微滴核被吸入呼吸道，植入肺泡发育繁殖导致结核发生； B. 引起结核病，随社区人群生活状况不同发病率有所差异，全球约有1/3人感染，有人类死亡之首和白色瘟疫之称； C. 免疫性：有菌免疫或称传染性免疫，细胞免疫在抗感染免疫中起重要作用。 D. 细菌可经血、淋巴，在骨、关节、肾、脑膜等处引起相应的结核病 致病物质荚膜：抗吞噬；细胞壁脂质；磷脂：刺激单核细胞增生、结核结节形成、干酪样坏死；分枝菌酸：抗酸性；索状因子：破坏线粒体膜；蜡质D：诱发IV型超敏反应；硫酸脑苷脂：抑制吞噬细胞；蛋白质； 致病机制：胞内寄生，细胞免疫为主，在巨噬细胞中存活，引起Ⅳ 型超敏反应。 （3）结核结节的形成： A. 是单核细胞参与的炎性肉芽肿反应，是细胞免疫和IV型变态反应平衡的结果； B. 细菌的脂质抵抗吞噬，巨噬细胞被破坏，形成原发感染。3~6周后，细胞变形，IV型变态反应产生； C. 磷脂刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞融合成多核巨细胞。抑制蛋白酶对组织溶解，产生干酪样坏死； （4）Koch现象（郭霍现象）和IV型变态反应： 有毒结核分枝杆菌被初次接种豚鼠10－14天，局部产生小节，形成肿块→坏死溃疡侵入附近淋巴结→淋巴血流全身播散，经久不愈→动物死亡。说明初次感染，机体无免疫力和超敏反应。 在8~12周之前先动物接种减毒小量结核分枝杆菌，再次接种结核分枝杆菌后局部反应提早出现，2~3天内红肿硬结溃疡痊愈。说明再次感染，机体有免疫力和超敏反应。 微生物学检验 标本采集: 根据病变部位不同而定 晨痰、支气管洗液、清晨的中后段尿 运送: 消毒容器 直接检查: 萋-尼抗酸染色 热 、Kinyoum染色 冷 ，金-胺O染色 消化: 4%NaOH 37℃ 15~30分钟；胰酶-新洁尔灭法；4%硫酸法（尿标本） 培养分离：罗琴培养基 鉴定: 烟酸、硝酸盐还原、触酶 药物敏感试验 （6）直接涂片染色镜检：痰厚涂片，齐-尼抗酸染色后，至少观察100个视野。结核分枝杆菌抗酸染色后呈红色，其他细菌和细胞为蓝色。结果应报告“找到或未找到抗酸性杆菌”，而不能报告“找到结核分枝杆菌”。可用计数法排除其他分支杆菌。 （7）结核分枝杆菌形态特征：① 细长、略弯曲杆菌，牛型结核分枝杆菌稍短；② 排列成团、成堆；；③ 抗酸染色阳性，治疗后菌体呈非抗酸性G+颗粒，称much颗粒（L型变异）；④ 金胺“O”染色菌体 呈黄色荧光； （8）分离培养： 标本接种于选择性固体培养基中，常用罗琴培养基，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长37℃，5％~10％CO2培养8周，如果出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为抗酸阳性，多数是结核杆菌。 鉴定： 1 PCR反向膜探针杂交EHSA法 PCR杂交梳 ； 2 DNA探针； 3 16s rRNA基因序列测定； 4 高效液相色谱 HPLC 检测 ； （9）培养特性： A. 最适温度35~37℃，最适pH6.4~6.8； B. 专性需氧，在液体培养基上形成菌膜，有毒株呈索状生长； C. 营养要求高，专嗜甘油为碳源，常用罗琴培养基 鸡蛋、甘油、枸橼酸钠、天门冬酸、马铃薯粉、孔雀绿、钾镁离子 ； D. 繁殖慢，一代需要18小时； E. 菜花样菌落，不规则凸起、不透明、粗糙，牛型结核分枝杆菌为光滑型； （10）生化反应：糖类发酵 - 热触酶 - Tween水解 - 热触酶 - 热磷酸酶 - ，为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌鉴定试验 ，后者阳性 烟酸试验 + 硝酸盐还原 + 中性红 + 烟酰胺酶试验 + 脲酶试验 + 牛型分枝杆菌均为阴性 结核分枝杆菌鉴别试验 （12）结核分枝杆菌抵抗力： 温度：菌悬液80℃5min、痰标本煮沸5min完全杀死细菌 光线：对紫外线敏感 干燥：对干燥或干热抵抗力强，干燥痰中可存活数周 化学因素：75%乙醇5min，石炭酸、来苏儿、甲醛敏感 分枝杆菌属快速鉴定程序： （14）结核分枝杆