食品中苏丹红I的免疫学快速检测方法研究.ppt

前言-苏丹红I检测现状 目前食品中苏丹红I的检测主要辅助仪器（ HPLC 、IAS-HPLC ）进行检测，而仪器检测方法普遍存在的缺陷在于： 1. 检测仪器昂贵 2. 检测成本高 3. 操作复杂 4. 耗时长 5. 需专业人员操作 6. 不适宜现场抽查及推广应用 一. 研究内容 1. 苏丹红I多克隆抗体的制备 2.3 苏丹红I多抗的制备 2.4 多克隆抗体的纯化 2.1 苏丹红I衍生物的合成结果 2.2 苏丹红I衍生物的色谱分析结果 2.3 苏丹红I免疫原的合成结果 2.4 SDS测定IgG的纯度 2.5 特异性IgG的浓度测定 一. 研究内容 2.1 间接竞争ELISA方法的建立 2.1.1 苏丹红I抗体效价的测定 2.1.2 苏丹红I抗体亲和力的测定 本实验利用竞争ELISA法，测定抗体的亲和力。 若抗体具备较强的亲和力强，则较少量半抗原即 可产生50 %的抑制率，故常用IC50，即产生50 % 抑制率时半抗原的浓度，来表示抗血清的亲和性， 以10 %抑制率时的苏丹红I浓度作为最低检测限。 抑制率=100 %-(OD1-OD阴性) /（OD2-OD阴性）×100 %， 其中，OD1为竞争孔的OD值，OD2为不含苏丹红I孔的OD值。 2.1.3 间接竞争ELISA的建立 酶标记的苏丹红I抗原与待测样品中可能存在的苏丹 红I竞争性的与固相载体上的苏丹红I抗体结合，显色程 度与样品中苏丹红I含量成反比。 2.1.4 待测样品的处理 2.1.5 交叉反应率测定 用建立的间接竞争ELISA法测定苏丹红其他染料，计算苏丹红I抗体的交叉反应率。 结果表明该方法与苏丹红II、苏丹红III和苏丹红IV的交叉反应率分别为2.7%、6.5%和4.1%，仅有较低的交叉反应性，说明该方法的特异性良好。 二. 免疫学检测方法的建立 2.1 金免疫层析技术概述 2.2 金免疫层析试纸工作原理 本研究应用竞争抑制免疫层析的原理，样品中的苏丹红I在流动的过程中与金标苏丹红I抗原，竞争结合NC膜检测线上苏丹红I多克隆抗体。通过检测线T是否显色判断结果。 2.2 胶体金免疫层析试纸法的建立 2.2.3 胶体金溶液的制备 胶体金的制备多采用还原法。 本研究利用柠檬酸三钠还原法制备24.5 nm的胶体金。 2.3.4 金标记抗原的制备 1. 用0.2 mol/L的K2CO3调节金溶胶至pH 9.0； 2. 将苏丹红I抗原与胶体金结合，搅拌15 min； 3. 加入PEG20 000，静止2h。低速离心25 min； 4. 取上清，高速离心50 min，弃上清； 5. 用稀释液将沉淀恢复至原体积，高速离心50 min； 6. 将沉淀（金标抗体）恢复至原体积的1/10。 2.3.5 胶体金免疫层析试纸的测试 配制标准浓度的待测液，使得苏丹红I的浓度分别为0, 5, 10, 15, 20 μg/kg。 取90 uL滴加在试纸的样品区，10 min后观察结果。 结果判断： 若C、T亮度基本一致，表示阴性结果； 若C线亮度明显亮于T线，表示阳性结果； 若均未出现C、T两线，表示该试纸无效。 2.3.6 试纸条测试结果 2.3.7 实际样品测定 2.3.8 ELISA、IC strip、HPLC三种方法的比较 为了验证两种方法的准确性，将检测结果同HPLC法进行比较。 谢谢大家！ 结果表明，这3种方法测定的结果具有高度相关性。测定结果为3次测试的平均值，变异系数≤10.7%。 阳性 阳性 阴性 阴性 试纸条 30.56 15.65 6.87 3.81 ELISA 31.89 15.91 7.82 3.93 HPLC 32.00 16.00 8.00 4.00 苏丹红I的实际添加浓度/(μg/kg) 检测 方法 表1 三种检测方法的比较 * * 食品中苏丹红I的免疫学快速检测方法研究 fuyunjie1985@163.com 前言 苏丹红I（1-苯基偶氮-2-萘酚），属于苏丹红染料的一种，作为化学合成染料，主要应用于鞋油、化妆品等工业产品及其他着色剂等领域。 苏丹红I在体内代谢，可被还原为初级代谢产物苯胺和1-氨基-2-萘酚，这些物质会攻击肝细胞，引起