实验四PCR扩增技术.pdf

实验四PCR扩增技术

精选ppt

一．实验目的及背景

l多聚酶链式反响(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年

代中期开展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，

可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，Ｐ

ＣＲ技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领

域，引起了生物技术开展的一次革命，目前它在分子克隆，目的根底检

测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。

lＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件

下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反响，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物

和模板ＤＮＡ结合的特异性。反响分三步：①变性〔denaturation〕；②

退火〔annealing〕；③延伸〔extension〕，反响过程见图。

精选ppt

l模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链；在５

５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分

别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ

聚合酶Taq酶催化下，在４种dNTP存在条件下

延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成

的ＤＮＡ为模板进行同样反响，如次往复循环30

次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，

３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。

成功的ＰＣＲ反响要求反响有很好的特异性和相

当的扩增效率。要达此目的ＰＣＲ反响要注意以

下问题：

精选ppt

1.ＤＮＡ模板：反响中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左

右。且ＤＮＡ纯度较高，以增加反响特异性。

2.dNTP:反响体系中达100μM～200μM。

3.Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基,浓度在2.0mM左右，浓度

太低Taq酶活力降低；太高反响特异性降低。

4.引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱

基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之间；引物内部不能

有回文序列；引物３’端不能互补。

精选ppt

5.Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，

在９５℃时３０分钟还有５０％活力。

6.变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。

7.复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引

物配对结合强弱而定，它是反响特异性的决定因素。

8.延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反响温度。

精选ppt

二．实验试剂及仪器

l１０×buffer:500mMKCl

100mMTris-HCl(pH9.0)

0.1%明胶

1%TritonX-100

lMgCl2.5mM

2

l４×dNTP:1mM

l引物：actin上，actin下

l模板：20ng/μl

lTaq酶：5u/μl

lPCR仪，凝胶成像系统，电泳系统

精选ppt

PCR仪