病毒感染细胞筛选.pdf

细胞筛选 一 嘌呤霉素 ( 一) 确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定， 或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。 一般而言， 嘌呤霉素 浓度范围在 2-10 微克 / 毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳 动物细胞系。 1. 培养待转染（而不是转染后）的细胞。 （筛 选的目的是杀灭未转染的细胞） 2. 取对数生长期的细胞 （一 般在铺满培养器皿底部的 7080%时），用新鲜无抗无血清的培养 基制成 1.5 ×105 个 的细胞悬液。 3. 向 96 孔培养板中加细胞悬液，每孔 100 微升（使每孔细胞 数在 1.5 ×104 个），然后向每孔加新鲜无抗无血 清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。 （这样做是为了保证 在固定细胞密度下确定最佳 G418药物筛选浓度。 ） 4. 第二天用嘌呤霉素浓度分别为 0, 2, 4, 6, 8, 10 微 克/ 毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培 养基。（每个浓度可用两个复孔， 相当于每个浓度测定三次） 。（注 意：对于多数细胞种类而言， 过量的嘌呤霉素能引起许多非必需 的表型的反应。 ） 5. 每日检查细胞活力， 根据细胞活力， 每三天 ( 即每隔两天 ) 更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一 次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天） 。 6. 在正常的实验操作规程时 ，一种细胞最优筛选浓度的确立 时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大 概需 3 到 14 天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死 亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。 最优浓度为 在 3-5 天内杀死所有细胞的浓度。 ( 二) 转染细胞 1. 第一天：在 60 培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天 细胞融合能达到 7080%的密度， 2 孵箱 过夜培养。 2. 第二天： 准备 3 无抗生素无血清培养基， 加入使其终浓度为 8 μ。将已经制备的病毒颗粒 0.5 加至上述培养基， 轻吹混匀。 去除 60 培养皿内的旧的培养 基，加入含病毒培养基。 （能够增加病毒感染的效率，然而，有 时候对细胞有毒性。这时，可以用 代替） ( 三) 筛选细胞 1. 病毒感染后 24 小时，可以换用含最优浓度的培养基。 2. 如果病毒对细胞有毒性， 可以减少感染时间至 4-6 小时，然 后换用新鲜培养基， 24-48 小时后换加含最优 浓度的培养基。最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入，观察 是否对细胞有毒性；如果没有毒性，还可以加入，作为是否有效 的对照。 3. 以后每隔一天换用新鲜含的无抗生素无血清培养基， 以替换 含大量死细胞的培养基。直到抗性 群落能被识别出（一般是在筛选后 10 到 12 天）。 4. 待抗性细胞长满以后，细胞转入 10 培养皿，同