表观遗传学的DNA甲基化检测技术.pdf

表表观观遗遗传传学学中中DNA甲甲基基化化检检测测技技术术的的研研究究进进展展与与应应用用

一一、、DNA甲甲基基化化的的生生物物学学意意义义

DNA甲基化是表观遗传修饰的核机制之一，主要指在DNA分子中胞嘧啶（C）的第5位碳原子上添加甲基基团（-CH），形

成5-甲基胞嘧啶（5mC）。这一过程通常发生在CpG二核苷酸位点（即胞嘧啶后接鸟嘌呤的序列）。甲基化通过调节基因表

达参与多种生物学过程，包括胚胎发育、基因组印记、X染色体失活以及肿瘤发生等。异常的DNA甲基化模式与癌症、神经退

行性疾病和代谢性疾病密切相关，因此其检测技术的研究具有重要的临床和科研价值。

二二、、DNA甲甲基基化化检检测测技技术术分分类类

根据检测目标的分辨率和技术原理，DNA甲基化检测方法可分为以下几类：

1.全全基基因因组组甲甲基基化化分分析析

这类技术旨在获取基因组范围内的甲基化图谱，适用于探索未知区域的甲基化模式。

甲基化敏感的限制性内切酶法（MS-RE）

通过使用对甲基化敏感的限制性内切酶（如HpaII和MspI）切割未甲基化的CpG位点，结合PCR或Southernblot分析差异切割

片段。该方法成本低但分辨率较低，仅适用于特定酶切位点的检测。

甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-Seq）

利用抗5mC抗体富集甲基化DNA片段，随后进行高通量测序。MeDIP-Seq可覆盖全基因组，但对高甲基化区域更敏感，低甲

基化区域可能被漏检。

2.位位点点特特异异性性甲甲基基化化检检测测

针对已知基因或特定CpG位点的甲基化状态进行分析，常用于临床诊断和机制研究。

甲基化特异性PCR（MSP）

通过设计区分甲基化和非甲基化DNA的引物，结合亚硫酸盐处理后DNA的序列差异进行扩增。MSP操作简单，但假阳性率较

高，需配合测序验证。

焦磷酸测序（Pyrosequening）

基于实时检测引物延伸过程中焦磷酸释放的信号，定量分析单个CpG位点的甲基化水平。其优势在于高精度和可重复性，适

用于临床样本的甲基化定量。

3.单单碱碱基基分分辨辨率率检检测测

可精确到单个CpG位点的甲基化状态，为功能研究提供高精度数据。

重亚硫酸盐测序（BisulfiteSequening）

原理：亚硫酸盐处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶（后续PCR中变为胸腺嘧啶），而甲基化的胞嘧啶保持不变。通过测

序比对转化后的序列，确定原始甲基化位点。

步骤：

1.DNA经亚硫酸盐处理并纯化；

2.目标区域PCR扩增；

3.克隆测序或高通量测序（如Illumina平台）。

优缺点：金标准方法，但存在DNA降解风险，且无法区分5mC与5hmC（羟甲基化）。

全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

结合亚硫酸盐转化与全基因组测序，提供单碱基分辨率的全基因组甲基化图谱。尽管成本高昂，但在研究复杂疾病机制中不可

或缺。

4.新新兴兴技技术术：：第第三三代代测测序序与与纳纳米米孔孔技技术术

单分子实时测序（SMRT,PaBio）

通过检测DNA聚合酶在合成链时的延迟信号，直接识别甲基化位点，无需亚硫酸盐处理。适用于长读长测序，但通量较低。

牛津纳米孔测序（OxfordNanopore）

利用电流变化检测DNA通过纳米孔时的甲基化修饰，可实时分析甲基化状态。该技术无需PCR扩增，适合检测稀有变异，但

当前分辨率仍待提升。

三三、、技技术术选选择择的的关关键键考考量量因因素素

1.分辨率需求：全基因组分析（如MeDIP-Seq）vs单碱基精度（如WGBS）；

2.样本类型与量：微量样本需选择高灵敏度方法（如Methylation-SpeifiqPCR）；

3.成本与通量：芯片技术（如IlluminaMethylationEPIC）适合大规模临床筛查，而WGBS适用于科研探索；

4.5mC与5hmC区分：氧化亚硫酸盐测序（oxBS-Seq）或TET酶辅助化学标记法可特异性检测5mC。

四四、、应应用用场场景景与与案案例例分分析析

1.癌癌症症早早期期诊诊断断与与分分型型

案例：结直肠癌中_SEPT9_基因启动子甲基化检测已用于无创血液筛查，灵敏度达90%；

技术选择：MSP或焦磷酸测序用于临床验证，甲基化芯片用于发现新标志物。

2.发发育育与与干干细细胞胞研研究究

案例：小鼠胚胎发育过程中全基因组去甲基化与重新甲基化动态；

技术选择：WGBS或单细胞甲基化测序（sBS-Seq）解析时空特异性变化。

3.环环境